Name: analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00
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Los autores desean dar las gracias a Michael Alifrangis y Abildtrup Ulla para el genotipado de los parásitos y Holm Christina para su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Howard Hughes Medical Institute (subvención de 55.005.511), la Fundación Lundbeck (subvención R9-A840) y por la Fundación Niels Bohr.

1. La generación de recién seleccionada eritrocitos infectados Para este ensayo, los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan cultivos recién seleccionadas para la expresión en superficie de la proteína PfEMP1. En este experimento particular la P. 3D7 linaje falciparum fue seleccionado utilizando anticuerpos específicos como se ha descrito anteriormente 1. Día 1 <ol><li> Cosecha de 200 l de células de sangre envasados ...

<ol>
	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

Análisis de ARN FISH, en contraste con los métodos tales como transferencia Northern y RT-PCR, permite la discriminación de los transcritos de ARNm específicos en el nivel de célula única. Esto hace que sea posible discriminar entre células transcripcionalmente activos e inactivos, en este ejemplo, P. falciparum protozoos parásitos dentro de los glóbulos rojos. Tales células enteras observaciones son a menudo necesarias y puede desentrañar los patrones transcripcionales importantes y novedosas 1...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de medio RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina </td></tr><tr><td> Albumax medios de comunicación: Gentamicina sulfato Albumax-solución </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml de solución de Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-solución: hipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g de hipoxantina </td></tr><tr><td> Albumax-solución: Albumax II </td><td> Yonvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-solución: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litros RPMI 1640 Disolver con el imán en el máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resina para desionizar formamida. </td></tr><tr><td> Anti-biotina peroxidasa de cabra pAb </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-DIG </td><td> Novus Productos Biológicos </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reactivo con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Los medios de montaje tiene que curar durante 24 h antes de sellar la corredera completamente. </td></tr><tr><td> La biotina RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara digital de </td><td> Digital Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> frasco de cultivo de 25 cm 2 de superficie Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC en 1000 ml de agua deinonized. Añadir una barra de agitación y se agita durante 12 h. Esterilizar en autoclave durante 30 min. </td></tr><tr><td> Cámara digital </td><td> Digital Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Proteína A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Imán </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Bioultra formamida 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formamida desionizada: 5 g de resina de intercambio iónico por 100 ml de formamida. Se agita 30 min. Filtrar a través de papel Whatman. </td></tr><tr><td> . 0 Gelatina solución al 75%: Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> . Gelatina 0 solución de 75%: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> La glutamina solución: L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtro sterilize y almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> Glutamina solución: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas. </td></tr><tr><td> Solución de hibridación: formamida al 99% de ultra Bio SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Total 20 ml, mantener congelado a -20 ° C en alícuotas 10 ml de formamida desionizada </td></tr><tr><td> Solución de hibridación: el concentrado 50x de Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Solución de hibridación: Levadura tRNARoche reactivo de bloqueo </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 l 20 mg por ml de ARNt de levadura </td></tr><tr><td><strong&gt; Solución de Hibridación: DNA de esperma de salmón </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0,4 g Roche reactivo de bloqueo 1 ml de 10 mg por ml de ADN de esperma de salmón (Critical: desnaturalizan salmón spermDNA a 96 ° C durante 5 min antes de añadir a la solución de hibridación) </td></tr><tr><td> Hybridizer Thermostar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Puede ser reemplazado por el horno de hibridación y las cámaras de RNasa libre de hibridación rellenados con agua DEPC. </td></tr><tr><td> Inmersión en aceite UV transparente, libre de fluorescencia </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocal de inmunofluorescencia o </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Disponible en cualquier farmacia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x PBS: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC desionizada H 2 O </td><td></td><td></td><td> Adecuar el pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA en 80 ml de PBS / DEPC. Calentar a 65 ° C hasta que se disuelve el PFA. Añadir 20 ml de PBS, permitir que la solución se enfríe. Ajustar el pH a 7,4. Filtrar. Almacenar en alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% / ácido acético 5% </td><td></td><td></td><td> 950 paraformaldhyde l de ácido acético + 50 l </td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado con peroxidasa anti-biotina </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml de RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina </td></tr><tr><td> RBC-wash medios de comunicación: Sulfato de Gentamicina </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml de gentamicina sulfato </td></tr><tr><td> RNasa </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Hacer una dosis de 10 mg / ml de solución madre. </td></tr><tr><td> RNasa libre de 1,5 ml tubo </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositivas 4 pozos de 11 mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> 20x SSC: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: Citrato de sodio dihidrato </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g de NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA en polvo </td><td></td><td></td><td> 9,4 g de EDTA en polvo Añadir agua DEPC, ajustar el pH 7,4. AutoHendió durante 20 min </td></tr><tr><td> TNB buffer: tampón TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml tampón TNT </td></tr><tr><td> TNB búfer: reactivo de bloqueo </td><td></td><td></td><td> 0,05 g de reactivo de bloqueo Para disolver el reactivo de bloqueo, se calienta la solución a 60 ° C durante una hora con agitación. Conservar a -20 ° C. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TNT tampón: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1 M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT buffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajustar el pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo). </td></tr><tr><td> TSA más Cyanine3 / fluoresceína sistema </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Leer el protocolo de la TSA Plus sistema de fluorescencia paleta cuidadosamente antes de iniciar el experimento. </td></tr><tr><td> Tubos de 14 ml estéril </td><td> Almeco - CM Aps LAB </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

La adhesión de Plasmodium falciparum eritrocitos infectados (IE) a receptores humanos endoteliales durante las infecciones de malaria está mediada por la expresión de PfEMP1 variantes de proteínas codificadas por los genes var. El P. haploide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 genes diferentes var de que ha sido único que se cree que ser transcrito por célula en un momento durante la fase sanguínea de la infección. Como tal regulación mutuamente excluyente de la transcripción de genes var que se logra es clara, ya que es la identificación de los genes var individuales o subgrupos de genes var asociados con diferentes receptores y la consecuencia de unión diferencial sobre el resultado clínico de P. infecciones por P. falciparum. Recientemente, el paradigma de la transcripción mutuamente excluyentes ha sido puesta en duda por los ensayos de transcripción basado en individuo P. falciparum identificación única transcripción en infeja células eritrocitarias utilizando ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) El análisis de la transcripción de genes var por el parásito en los núcleos individuales de P. falciparum IE 1. Aquí, se presenta un protocolo detallado para llevar a cabo la metodología de ARN-FISH para el análisis de la transcripción de genes var en un solo núcleo de P. falciparum infecta los eritrocitos humanos. El método se basa en el uso de digoxigenina y biotina marcado con sondas de ARN antisentido utilizando el TSA Plus fluorescencia sistema de paletas 2 (Perkin Elmer), los análisis microscópicos y recién seleccionado P. falciparum IE. El método de hibridación in situ se puede utilizar para controlar la transcripción y la regulación de una variedad de genes expresados ​​durante las diferentes etapas de la P. ciclo de vida falciparum y es adaptable a otras especies de parásito de la malaria y otros organismos y tipos de células.

La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de los pasos principales y el tiempo de duración de la metodología de ARN FISH. Una serie de imágenes representativas de bien y mal conservados experimentos manchadas de ARNm de peces utilizando solo P. falciparum IE se muestra en la Figura 2. Este protozoo intracelular tiene un pequeño (1-1.5 m de diámetro) núcleo que se tiñe de azul con DAPI. Veinticuatro horas después de la invasión de los eritroc...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescente<em&gt; In situ</emHibridación&gt; (FISH) para identificar las transcripciones de mRNA en células individuales permite el análisis de la actividad poligénica tales como la transcripción simultánea de más de un miembro de la<em&gt; Var</em&gt; Multigene familia en<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Eritrocitos infectados<sup&gt; 1</sup&gt;. La técnica es adaptable y puede ser utilizado en diferentes tipos de genes, células y organismos.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

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