Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر انكه Rüttgeroth وزيمرمان كارينا للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (NI 1301/1-1 منحة لVON) وجامعة غوتنغن المركز الطبي (&quot;برو FUTURA&quot; منحة لVON).

1. إنشاء الحنق مجهر التصوير من حيث المبدأ، يمكن تكييفها أي مضان المجهر المقلوب الذي يتوفر في المختبر ويحتوي على منفذ لكاميرا التصوير الحنق. يجب الإعداد النهائي وتشمل المكونات التالية الحاسمة: مجهر، مصدر الضوء مع أو بدون مصراع إضاف...

<ol>
	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

في هذا البروتوكول، ونحن لشرح كيفية بناء نظام التصوير بسيطة منخفضة التكلفة ولكنها قوية للتطبيقات الروتينية الحنق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار المتاحة. تم تصميم نظام المعروضة هنا لCFP وYFP، أو أنواع مماثلة من البروتينات الفلورية، حيث يتحرك هذا الزوج المانحين متق...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / معدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> BES الاحتياطي الصف </td><td> APPLICHEM </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 تبلور </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> الزجاج coverslides </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 004710781 </td><td> قطر 24 مم </td></tr><tr><td> الزجاجي لزراعة الخلايا الأطباق </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM المتوسطة </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل (FCS) </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيجما </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيجما </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 هيدرات </td><td> APPLICHEM </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> APPLICHEM </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> نا 2 HPO 4 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> نيون المجهر المقلوب </td><td> على سبيل المثال نيكون </td><td> الطلب في نيكون </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> ف E-100 </td><td> 440 نيوتن متر </td></tr><tr><td> العرض الثنائي </td><td> Photometrics </tد&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> العرض الثنائي مرشح التمرير </td><td> Photometrics </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP مجموعة التصفية </td><td> صفاء التكنولوجيا </td><td> 49052 </td><td> دون تصفية الانبعاثات </td></tr><tr><td> ORCA-03G الكاميرا </td><td> هاماماتسو الضوئيات </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> اردوينو I / O المجلس </td><td> Sparkfun إلكترونيات </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor الخلية غرفة </td><td> إينفيتروجن </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> كمبيوتر شخصي مع نظام windows7 ويندوز إكس بي أو </td><td> أي مورد </td><td></td><td> وتشمل القرص الصلب مع قدرة عالية </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) المجهر تواصل كسب اهتمام متزايد كأسلوب لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث البيوكيميائية ويشير في الخلايا الحية والأنسجة. بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية البيوكيميائية، وتتميز هذه التكنولوجيا رواية عالية الدقة الزمنية والمكانية. الحنق تجارب استخدام مختلف وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار التي يمكن التعبير عنها وتصويرها على مر الزمن في الموقع أو في الجسم الحي 1-2. يمكن أجهزة الاستشعار التقليدية تقريرا إما البروتين البروتين التفاعلات عن طريق قياس الحنق بين زوج fluorophore الموسومة البروتينات أو تغييرات في بتكوين بروتين واحد الذي يؤوي المانحة ومتقبل fluorophores مترابطة مع شاردة ملزمة لجزيء من مصلحة 3-4. أجهزة الاستشعار عن ثنائي الجزيء البروتين البروتين التفاعلات تشمل، على سبيل المثال، يبني مصممة لرصد بروتين G-التنشيط في خلايا 5، في حين أن أجهزة الاستشعار unimolecular شركة طيران الشرق الأوسطوتستخدم على نطاق واسع التغيرات بتكوين suring لرسل الصورة الثانية مثل الكالسيوم 6، مخيم 7-8، الفوسفات اينوزيتول 9 و المركب 10-11. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من واحد المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية السيطرة على كامل الإعداد باستخدام مجانية الصغرى، مدير. تم تصميم هذه الأداة بسيطة ولكنها قوية لقياسات روتينية أو أكثر تطورا الحنق في الخلايا الحية. تتم معالجة الصور باستخدام المكتسبة الذاتية المكتوبة المكونات الإضافية لرؤية التغييرات في نسبة الحنق في الوقت الحقيقي في أي تجارب قبل أن يتم تخزينها في شكل رسومات متوافقة مع البناء في يماغيج مجانية المستخدمة لتحليل البيانات اللاحقة. ويتميز هذا النظام منخفضة التكلفة من مرونة عالية، ويمكن استخدامها بنجاح لرصد الأحداث البيوكيميائية المختلفة والجزيئات يشير من قبل عدد كبير من أجهزة الاستشعار المتاحة الحنق في الخلايا الحية والأنسجة. وكمثال على ذلك، علينا أن نبرهن حآه لاستخدام هذا النظام لأداء التصوير في الوقت الحقيقي رصد المخيم في الخلايا الحية على التحفيز 293A مع مستقبلات β ناهض الأدرينالية ومانع.

Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو تقنية المجهر قوية لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث يشير في الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار المختلفة وصحفيين. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية استخدامها لتجارب الحنق.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

الجمع بين QD - الحنق و microfluidics الحمض النووي لرصد Nanocomplex الذاتي الجمعية في الوقت الحقيقي

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

في الوقت الحقيقي رصد يجند مستقبلات التفاعل مع الإسفار نقل الطاقة الرنين

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

تحفيز الصور بواسطة ليزر Femtosecond ينشط إشارات الكيناز (ERK) أو أحداث الميتوكوندريا في الخلايا المستهدفة

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...