Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

De auteurs willen graag Anke Rüttgeroth en Karina Zimmermann bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subsidie ​​NI 1301/1-1 te VON) en de Universiteit van Göttingen Medisch Centrum (&quot;pro Futura&quot; subsidie ​​aan VON).

1. Het opzetten van een FRET Imaging Microscoop In principe kan elk omgekeerde fluorescentiemicroscoop die beschikbaar in het laboratorium en een camera poort worden aangepast voor FRET imaging. De laatste setup moet de volgende cruciale onderdelen: een microscoop, een lichtbron met of zonder extra sluiter, een bundel-splitter voor emissie licht en een CCD-camera (zie figuur 1). De hardware, vooral de lichtbron, de sluiter en de camera zijn geïntegreerd in en gecontroleerd do...

<ol>
	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

in dit protocol, laten we zien hoe je een eenvoudige en goedkope, maar krachtig FRET imaging-systeem voor routinematige toepassingen met een verscheidenheid van beschikbare biosensoren te bouwen. Het systeem hier gepresenteerde is ontworpen voor CFP en YFP, of soortgelijke vormen van fluorescerende eiwitten, omdat de donor-acceptor paar. Ondertussen andere individuele biosensoren beschikbaar die gebruik bijvoorbeeld groen en rood fluorescerende eiwitten 14. De beschreven voor andere kleuren aan, dienen passen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> BES Buffer Grade </td><td> Applichem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 dihydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Glas Dekglaasjes </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Diameter 24 mm </td></tr><tr><td> Glazen bodem cel-cultuur gerechten </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM medium </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalfsserum (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 hexahydraat </td><td> Applichem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Applichem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde fluorescentiemicroscoop </td><td> bijvoorbeeld Nikon </td><td> Aanvraag bij Nikon </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Lichttechniek </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView filter slider </td><td> Lichttechniek </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP filterset </td><td> Chroma Technology </td><td> 49052 </td><td> zonder emissiefilter </td></tr><tr><td> ORCA-03G camera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino I / O-kaart </td><td> Sparkfun Electronics </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor celkamer </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Personal computer met WindowsXP of Windows7-systeem </td><td> Elke leverancier </td><td></td><td> Inclusief harde schijf met een hoge capaciteit </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie blijft winnen toenemende belangstelling als een techniek voor real-time monitoring van biochemische en signalering gebeurtenissen in levende cellen en weefsels. Vergeleken met klassieke biochemische werkwijzen wordt deze nieuwe technologie gekenmerkt door een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. FRET proeven met verschillende genetisch gecodeerde biosensoren die kan worden uitgedrukt en de tijd afgebeeld in situ of in vivo 1-2. Typische biosensoren kan melden eiwit-eiwit interacties door het meten FRET tussen een fluorofoor-gemerkte paar eiwitten of conformationele veranderingen in een eiwit dat donor en acceptor fluoroforen verbonden met een bindingsdeel voor een molecuul van belang herbergt 3-4. Bimoleculaire biosensoren voor eiwit-eiwit interacties omvatten bijvoorbeeld constructen ontworpen om G-eiwit activatie in cellen 5 volgen, terwijl de sensors unimoleculaire meaSuring conformationele veranderingen worden op grote schaal gebruikt om beeld second messengers zoals calcium 6, cAMP 7-8, inositol fosfaten 9 en cGMP 10-11. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van enkele commercieel verkrijgbare componenten en hoe je de hele set-up met behulp van de Micro-Manager freeware te controleren. Deze eenvoudige maar krachtige instrument is ontworpen voor routine of meer geavanceerde FRET metingen in levende cellen. Verkregen beelden worden verwerkt met behulp van zelfgeschreven plug-ins voor veranderingen in FRET ratio in real-time visualiseren tijdens een experiment alvorens te worden opgeslagen in een grafische indeling die compatibel is met de ingebouwde ImageJ freeware gebruikt voor de volgende data-analyse. Deze goedkope wordt gekenmerkt door hoge flexibiliteit en met succes kan worden gebruikt om verschillende biochemische gebeurtenissen en signaalmoleculen controleren door een overvloed van beschikbare biosensoren FRET in levende cellen en weefsels. Als voorbeeld tonen we how deze imaging systeem om real-time monitoring van cAMP voeren in levende 293A cellen na stimulatie met een β-adrenerge receptor agonist en blocker.

Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time monitoring van ligand-receptor interacties met Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen van muizen, de mens en Porcine Origin Met behulp van fluorescentie-gelabelde Nanodeeltjes

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...