Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Anke Rüttgeroth und Karina Zimmermann für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Stipendium NI 1301/1-1 bis VON) und der University of Göttingen Medical Center (&quot;pro futura&quot; Zuschuss VON) unterstützt.

Ein. Einrichten eines FRET Imaging Microscope Im Prinzip kann jedes invertierten Fluoreszenzmikroskop erhältlichen im Labor ist und eine Kamera-Anschluss angepasst für FRET Bildgebung werden. Die endgültige Einstellung sollte folgende wesentliche Bestandteile: ein Mikroskop, eine Lichtquelle mit oder ohne zusätzliche Auslöser, ein Strahlteiler zur Emission Licht und einer CCD-Kamera (siehe Abbildung 1). Die Hardware-Geräte, insbesondere die Lichtquelle, der Verschluss un...

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	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. 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U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

in diesem Protokoll zeigen wir, wie man eine einfache Low-Cost, aber leistungsstarke FRET Imaging-System für Routine-Anwendungen mit einer Vielzahl von verfügbaren Biosensoren bauen. Das hier vorgestellte System ist für GFP und YFP oder ähnlichen Typen von fluoreszierenden Proteinen, wie die Donor-Akzeptor-Paar. Unterdessen werden andere individuelle Biosensoren zur Verfügung, verwenden zum Beispiel grün und rot fluoreszierenden Proteinen 14. Um das beschriebene System für andere Farben anzupassen, sin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> BES-Puffer Grade </td><td> AppliChem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2-Dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Glass coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Durchmesser 24 mm </td></tr><tr><td> Glasboden-Zellkultur-Schalen </td><td> World Precision Instruments </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM-Medium </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 Hexahydrat </td><td> AppliChem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> AppliChem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Invertierte Fluoreszenzmikroskop </td><td> zB Nikon </td><td> Anfrage bei Nikon </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Photometrics </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView Filterschieber </td><td> Photometrics </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP Filter-Set </td><td> Chroma Technology </td><td> 49052 </td><td> ohne den Emissionsfilter </td></tr><tr><td> ORCA-03G-Kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino I / O-Platine </td><td> Sparkfun Electronics </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor Zellkammer </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Personal Computer mit Windows XP oder Windows7-System </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td> Include Festplatte mit hoher Kapazität </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Mikroskopie weiterhin zunehmendes Interesse als Technik zur Echtzeit-Überwachung von biochemischen und Signaltransduktion in lebende Zellen und Gewebe zu gewinnen. Im Vergleich zu klassischen biochemischen Methoden wird diese neuartige Technologie durch hohe zeitliche und räumliche Auflösung aus. FRET-Experimente verwenden verschiedene genetisch-codierten Biosensoren, die berechnet und abgebildet werden im Laufe der Zeit in situ oder in vivo 1-2 können. Typische Biosensoren können entweder berichten Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch Messen von FRET zwischen einem Fluorophor-markierten Paar von Proteinen oder Konformationsänderungen in einem einzelnen Protein, das Donor-und Akzeptor-Fluorophoren mit einem Bindungsanteil für ein Molekül von Interesse verbunden 3-4 birgt. Bimolekularen Biosensoren für Protein-Protein-Interaktionen umfassen beispielsweise, konstruiert zur G-Protein-Aktivierung in den Zellen 5 überwachen, während die unimolekularen Sensoren meaSuring Konformationsänderungen werden weit an image Botenstoffe wie Calcium 6, cAMP 7-8, Inositolphosphate 9 und cGMP 10-11 verwendet. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus einzelnen kommerziell verfügbaren Komponenten und wie man das ganze Setup mit dem Micro-Manager freeware steuern. Diese einfache, aber leistungsfähige Gerät ist für den Routine oder mehr anspruchsvolle FRET-Messungen in lebenden Zellen konzipiert. Aufgenommenen Bilder werden unter Verwendung selbst geschriebenen Plug-Ins, um Änderungen in FRET-Verhältnis in Echtzeit während allen Experimenten zu visualisieren, bevor sie in einem Grafik-Format gespeichert werden mit der Build-in ImageJ freeware für spätere Datenanalyse verwendet. Diese Low-Cost-System zeichnet sich durch hohe Flexibilität aus und kann erfolgreich eingesetzt werden, um verschiedene biochemische Vorgänge und Signalmolekülen durch eine Vielzahl von zur Verfügung zu überwachen FRET Biosensoren in lebenden Zellen und Geweben. Als ein Beispiel zeigen wir how diese Bildgebungssystem zu verwenden, um die Echtzeit-Überwachung von cAMP in lebenden 293A-Zellen nach Stimulation mit einem β-adrenergen Rezeptor-Agonisten und-Blocker durchzuführen.

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FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Forschung

Biologie

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...