Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לאנקת רוטגרות&#39; וקארינה צימרמן לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (מענק NI 1301/1-1 לפון) ואוניברסיטת גטינגן במרכז רפואי (&quot;פרו Futura&quot; מענק לפון).

1. הגדרת סריג מיקרוסקופ הדמיה בעיקרון, כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך אשר זמין במעבדה ויש לו יציאת מצלמה יכול להיות מותאם לסריג הדמיה. ההגדרה האחרונה צריכה לכלול את המרכיבים הבאים החשובים: מיקרוסקופ, מקור אור, עם או בלי תריס נוסף, קו...

<ol>
	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לבנות מערכה בעלות נמוכה אבל חזקה סריג פשוטה ליישומי הדמיה שיגרתי עם מגוון רחב של חיישנים ביולוגיים זמינים. המערכת שהוצגה כאן מיועדת לCFP וYFP, או סוגים דומים של חלבוני ניאון, כזוג-acceptor התורם. בינתיים, biosensors הבודד האחר שיהיו זמין להשתמש למשל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב / הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BES מאגר הכיתה </td><td> AppliChem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> 2 dihydrate CaCl </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> coverslides זכוכית </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> קוטר 24 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> רצפת זכוכית מנות תא תרבות </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני D-MEM </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 hexahydrate </td><td> AppliChem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> AppliChem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך </td><td> למשל ניקון </td><td> בקשה בניקון </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> p E-100 </td><td> 440 ננומטר </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Photometrics </tד&gt; <td> Dv2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> מחוון מסנן DualView </td><td> Photometrics </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> סט CFP / YFP מסנן </td><td> טכנולוגית Chroma </td><td> 49052 </td><td> ללא פליטת המסנן </td></tr><tr><td> מצלמת ORCA-03G </td><td> Hamamatsu פוטוניקס </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino לוח קלט / פלט </td><td> Sparkfun אלקטרוניקה </td><td> Dev-00666 </td><td></td></tr><tr><td> תא התא Attofluor </td><td> Invitrogen </td><td> -7816 </td><td></td></tr><tr><td> מחשב אישי עם מערכת WindowsXP או Windows7 </td><td> כל ספק </td><td></td><td> כולל כונן קשיח עם קיבולת גבוהה </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופיה ממשיכה לצבור עניין גובר כטכניקה לניטור בזמן אמת של אירועים ביוכימיים ואיתות בתאים ורקמות חיות. בהשוואה לשיטות קלסיות ביוכימיים, טכנולוגיה חדשנית זו מתאפיינת ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. סריג ניסויים להשתמש biosensors השונה גנטי מקודד אשר יכול לבוא לידי ביטוי, וצלם לאורך הזמן באתר או בvivo 1-2. biosensors הטיפוסי יכול לדווח על אינטראקציות בין חלבונים על ידי מדידת הסריג בין זוג fluorophore מתויג-של חלבונים או שינויים קונפורמציה בחלבון יחיד שמטפחים תורם וfluorophores acceptor מקושר עם מחצית מחייבת למולקולה של עניין 3-4. biosensors bimolecular לאינטראקציות בין חלבונים כולל, למשל, בונה נועד לפקח הפעלת G-חלבון בתאים 5, בעוד חיישני unimolecular meaשינויים קונפורמציה Suring נמצאים בשימוש נרחב לשליחים שניים תמונה כגון סידן 6, 7-8 מחנה, פוספטים אינוסיטול 9 ו cGMP 10-11. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים זמינים מסחרי בודדים ואיך לשלוט בכל ההתקנה באמצעות מנהל freeware-מייקרו. מכשיר פשוט אך רב עצמה זו נועד למדידות שגרתיות או מתוחכמות יותר סריג בתאים חיים. תמונות נרכשות מעובדות באמצעות תוספות עצמיות כתובות לדמיין שינויים ביחס סריג בזמן האמת במהלך כל ניסויים לפני שמאוחסן בתבנית גרפית תואם עם build-בfreeware ImageJ משמש לניתוח נתונים שלאחר מכן. עלות מערכת נמוכה זה מאופיין בגמישות גבוהה וניתן להשתמש בו בהצלחה לניטור אירועים ביוכימיים שונים ומולקולות איתות על ידי שפע של סריג biosensors זמין בתאים ורקמות חיות. כדוגמה, אנחנו מדגימים hאוו לשימוש במערכת הדמיה זה כדי לבצע ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי 293A חיים על גירוי עם אגוניסט וחסמי רצפטור β-adrenergic.

Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...