Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Анке Rüttgeroth и Карина Zimmermann для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант NI 1301/1-1 фон) и Геттингенском университете Медицинского Центра (&quot;за Futura&quot; грант VON).

1. Настройка FRET визуализации микроскопа В принципе, любой инвертированный микроскоп флуоресценции, которая доступна в лаборатории и имеет порт камеры могут быть адаптированы для FRET изображений. Окончательная настройка должна включать следующие важные компоненты: микро...

<ol>
	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

В этом протоколе, мы покажем, как построить простой недорогой, но мощный FRET системы визуализации для обычных приложений с различных доступных биосенсоров. Система, представленная здесь, предназначена для CFP и YFP или аналогичных типов флуоресцентных белков, как донорно-акцепторных пар. ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента / оборудования </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> BES буфера класс </td><td> AppliChem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 дигидрат </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Стекло coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Диаметр 24 мм </td></tr><tr><td> Стеклянным дном клеточной культуры блюд </td><td> Инструменты Всемирной Precision </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM среде </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Глютамин </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Сигма </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Сигма </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 гексагидрата </td><td> AppliChem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> AppliChem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Перевернутый флуоресцентного микроскопа </td><td> например Nikon </td><td> Запрос на Nikon </td><td></td></tr><tr><td> Охлаждается </td><td> Охлаждается </td><td> р E-100 </td><td> 440 нм </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Фотометрия </tD&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView фильтр слайдер </td><td> Фотометрия </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP набор фильтров </td><td> Chroma технологии </td><td> 49052 </td><td> без фильтра испускания </td></tr><tr><td> ORCA-03G камеры </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino платы ввода / вывода </td><td> SparkFun Electronics </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor ячейки камеры </td><td> Invitrogen </td><td> -7816 </td><td></td></tr><tr><td> Персональный компьютер с WindowsXP или Windows7 системы </td><td> Любой поставщик </td><td></td><td> Включите жесткий диск с большой емкостью </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопии продолжает набирать все больший интерес как метод для мониторинга в реальном времени биохимических и сигнальных событий в живых клетках и тканях. По сравнению с классическими биохимическими методами, эта новая технология характеризуется высоким временным и пространственным разрешением. FRET экспериментах используют различные генетически закодированный биосенсоры, которые могут быть выражены и отображаемого с течением времени на месте или в естественных условиях 1-2. Типичные биосенсоров может либо сообщить белок-белковых взаимодействий путем измерения FRET между флуорофором с метками пары белков или конформационных изменений в единый белок, который питает донора и акцептора флуорофоров взаимосвязаны с обязательным фрагментом для молекулы интереса 3-4. Бимолекулярные биосенсоры для белок-белковых взаимодействий относятся, например, строит, предназначенная для контроля G-белок активации в клетках 5, в то время как мономолекулярный датчики измеренияSuring конформационные изменения, которые широко используются для изображения вторичные мессенджеры, такие как кальций 6, цАМФ 7-8, инозитфосфатов 9 и цГМФ 10-11. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET система визуализации от одного коммерчески доступных компонентов и, как контролировать все настройки с помощью Micro-менеджер бесплатно. Этот простой, но мощный инструмент предназначен для регулярного или более сложные FRET измерений в живых клетках. Полученные изображения обрабатываются с помощью самостоятельной письменной плагинов для визуализации изменений в соотношении FRET в режиме реального времени во время любых экспериментов перед сохранением в графическом формате совместимым с встроенным в ImageJ бесплатной использованы для последующего анализа данных. Эта недорогая система характеризуется высокой гибкостью и могут быть успешно использованы для мониторинга различных биохимических событий и сигнальные молекулы множество доступных FRET биосенсоров в живых клетках и тканях. В качестве примера мы покажем, чвл использовать это изображение системы для выполнения мониторинга в реальном времени цАМФ в клетках живых 293А при стимуляции β-адренорецепторов агонистов рецепторов и блокатора.

Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопия является мощным средством для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках с помощью различных биосенсоров, как журналисты. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET системы формирования изображения из коммерчески доступных компонентов и как использовать его для FRET экспериментов.

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Объединение QD-FRET и Microfluidics для мониторинга ДНК Nanocomplex самосборки в режиме реального времени

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Обработки изображений G-белком рецептор-опосредованный хемотаксис и его сигнальных событий в нейтрофилами как клетки HL60

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Характеристика кальцификации событий с использованием живого оптической и электронной микроскопии методы в морской Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Фотостимуляция Femtosecond Laser активирует внеклеточные сигналы, регулируемые Kinase (ERK) Сигнализация или Митохондриальные События в целевых клетках

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...