Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Anke Rüttgeroth Zimmermann y Karina de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención NI 1301/1-1 a VON) y la Universidad de Göttingen Medical Center (&quot;pro futura&quot; otorgamiento de VON).

1. La creación de un microscopio de imagen FRET En principio, cualquier microscopio de fluorescencia invertido que está disponible en el laboratorio y tiene un puerto de la cámara puede adaptarse para FRET formación de imágenes. La configuración final debe incluir los siguientes componentes fundamentales: un microscopio, una fuente de luz con o sin obturador adicional, un divisor de haz de emisión de luz y una cámara CCD (ver Figura 1). Los dispositivos de hardware, es...

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	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

en este protocolo, se demuestra cómo crear un simple y de bajo costo pero de gran alcance FRET sistema de imágenes para aplicaciones de rutina con una variedad de biosensores disponibles. El sistema que aquí se presenta está diseñado para PPC y YFP, o tipos similares de proteínas fluorescentes, como la pareja donante-aceptor. Mientras tanto, otros biosensores individuales estén disponibles que utilizan por ejemplo las proteínas fluorescentes verdes y rojas 14. Para adaptar el sistema descrito para otr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> BES Buffer Grado </td><td> AppliChem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 dihidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Diámetro 24 mm </td></tr><tr><td> Con fondo de cristal platos de cultivo celular </td><td> World Precision Instruments </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 hexahidratado </td><td> AppliChem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> AppliChem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia invertido </td><td> por ejemplo, Nikon </td><td> Solicitud de Nikon </td><td></td></tr><tr><td> Coolled </td><td> Coolled </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Fotometría </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView filtro regulador </td><td> Fotometría </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> CFP / YFP Juego de filtros </td><td> Tecnología Chroma </td><td> 49052 </td><td> sin el filtro de emisión </td></tr><tr><td> ORCA-03G cámara </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino I / O </td><td> Sparkfun Electronics </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor cámara de la célula </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Ordenador personal con sistema Windows XP o Windows 7 </td><td> Cualquier proveedor </td><td></td><td> Incluye unidad de disco duro de alta capacidad </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía continúa ganando creciente interés como una técnica para la monitorización en tiempo real de eventos bioquímicos y de señalización en las células vivas y tejidos. En comparación con los métodos bioquímicos, esta nueva tecnología se caracteriza por una alta resolución temporal y espacial. FRET experimentos utilizar diversos genéticamente codificados con biosensores que pueden ser expresados ​​y la imagen con el tiempo in situ o in vivo 1-2. Biosensores típicos pueden reportar interacciones proteína-proteína mediante la medición de FRET entre un par fluoróforo de etiquetado de proteínas o cambios conformacionales en una única proteína que alberga fluoróforos donante y aceptor interconectados con un resto de unión para una molécula de interés 3-4. Biosensores bimoleculares para las interacciones proteína-proteína incluyen, por ejemplo, construye diseñado para controlar la activación de la proteína G en las células 5, mientras que los sensores unimoleculares meamedida digital cambios conformacionales son ampliamente utilizados para mensajeros segunda imagen tales como calcio 6, cAMP 7-8, fosfatos de inositol 9 y cGMP 10-11. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes individuales de los componentes disponibles en el mercado y cómo controlar la configuración de todo el software gratuito con Micro-Manager. Este instrumento simple pero potente está diseñado para mediciones de rutina o más sofisticado FRET en células vivas. Imágenes obtenidas son procesadas usando auto-escrito plug-ins para visualizar los cambios en la relación de FRET en tiempo real durante todo experimento antes de ser almacenada en un formato de gráficos compatible con la construcción, en ImageJ software gratuito utilizado para el análisis posterior de los datos. Este sistema de bajo costo se caracteriza por una alta flexibilidad y puede ser utilizado con éxito para controlar varios eventos bioquímicos y moléculas de señalización por una plétora de biosensores disponibles FRET en células vivas y tejidos. Como un ejemplo, se demuestra hómo utilizar este sistema de imagen para realizar monitoreo en tiempo real de cAMP en células vivas de 293A a la estimulación con un agonista de los receptores β-adrenérgicos y bloqueantes.

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FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Investigación

Biología

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Fotoestimulación por láser de femtosegundo activa la señalización de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) o eventos mitocondriales en células objetivo

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...