Name: fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

Författarna vill tacka Anke Rüttgeroth och Karina Zimmermann för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag NI 1301/1-1 till VON) och universitetet i Göttingen Medical Center (&quot;Pro Futura&quot; bidrag till VON).

1. Att sätta upp en FRET Imaging mikroskop I princip kan vilken som helst inverterat fluorescensmikroskop som finns i labbet och har en kamera port anpassas för FRET avbildning. Den slutliga installationen bör innehålla följande viktiga komponenter: ett mikroskop, en ljuskälla med eller utan ytterligare slutare, en stråldelare för emission ljus och en CCD-kamera (se figur 1). Maskinvaruenheter, särskilt ljuskällan, slutaren och kameran är integrerade i och styrs av ...

<ol>
	<li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses.">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+from+the+field:+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems.">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling.">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li><li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics.">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells.">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li><li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1,4,5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations.">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li><li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells.">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li><li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors.">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li><li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells.">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li><li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells.">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li><li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light.">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036 (2009).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li><li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin.">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li><li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors.">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li></ol>

i detta protokoll visar vi hur man bygger en enkel billig men kraftfull FRET avbildning för rutinmässiga tillämpningar med olika tillgängliga biosensorer. Systemet som presenteras här är utformat för GFP och YFP, eller liknande typer av fluorescerande proteiner, som donator-acceptor-par. Samtidigt andra enskilda biosensorer blir tillgängliga som använder till exempel gröna och röda fluorescerande proteiner 14. För att anpassa det beskrivna systemet för andra färger, bör lämpliga ljuskällor oc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens / utrustning </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> BES buffert Grade </td><td> AppliChem </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaClj 2 dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Glas coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> Diameter 24 mm </td></tr><tr><td> Glasbottnad cell-odlingsplattor </td><td> World Precision Instruments </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM-medium </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgClj 2 hexahydrat </td><td> AppliChem </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> AppliChem </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Inverterat fluorescensmikroskop </td><td> t.ex. Nikon </td><td> Begäran Nikon </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Ljustekniska </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView filter reglaget </td><td> Ljustekniska </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> Fiskeripolitiken / YFP filteruppsättningen </td><td> Chroma Technology </td><td> 49.052 </td><td> utan emissionsfilter </td></tr><tr><td> ORCA-03G kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino I / O-kort </td><td> Sparkfun Elektronik </td><td> DEV-00.666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor cellkammare </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Persondator med WindowsXP eller Windows7 systemet </td><td> Någon leverantör </td><td></td><td> Inkludera hårddisk med hög kapacitet </td></tr></tbody></table>

fret microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors

Förster resonans (FRET) mikroskopi fortsätter att vinna ökat intresse som en teknik för realtidsövervakning av biokemiska och signalering händelser i levande celler och vävnader. Jämfört med klassiska biokemiska metoder är denna nya teknik kännetecknas av hög temporal och spatial upplösning. FRET experiment använder olika genetiskt kodade biosensorer som kan uttryckas och avbildas med tiden in situ eller in vivo 1-2. Typiska biosensorer kan antingen rapportera protein-proteininteraktioner genom att mäta FRET mellan en fluorofor-märkt par av proteiner eller konformationsförändringar i ett enda protein som härbärgerar donator-och acceptormolekyler sammankopplade med en bindande del för en molekyl av intresse 3-4. Bimolekylära biosensorer för protein-proteininteraktioner inkluderar, till exempel, konstruktioner utformats för att övervaka G-protein-aktivering i celler 5, medan de unimolekylära sensorerna MEASuring konformationsförändringar används ofta för att bilden sekundära budbärare såsom kalcium 6, 7-8 cAMP, inositolfosfater 9 och cGMP 10-11. Här beskriver vi hur man bygger en anpassad epifluorescens FRET bildsystem från enstaka kommersiellt tillgängliga komponenter och hur man kan kontrollera hela installationen med hjälp av Micro-Manager freeware. Denna enkla men kraftfulla verktyg är utformat för rutinmässiga eller mer sofistikerade FRET mätningar i levande celler. Förvärvade bilder bearbetas med egen skriftlig plug-ins för att visualisera förändringar i FRET förhållande i realtid under några experiment innan de lagras i ett grafiskt format som är kompatibelt med inbyggd ImageJ gratisprogram som används för efterföljande dataanalys. Detta låg kostnad system kännetecknas av hög flexibilitet och kan med framgång användas för att övervaka olika biokemiska händelser och signalmolekyler genom en uppsjö av tillgängliga FRET biosensorer i levande celler och vävnader. Som ett exempel, visar vi hOW att använda denna avbildning för att utföra realtidsövervakning av cAMP i levande 293A celler vid stimulering med en β-adrenergisk receptoragonist och blockerare.

Watch this Scientific Journal Video about FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors at JoVE.com

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster resonans (FRET) mikroskopi är en kraftfull teknik för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler med olika biosensorer som reportrar. Här beskriver vi hur man bygger en anpassad epifluorescens FRET bildsystem från kommersiellt tillgängliga komponenter och hur man använder den för FRET experiment.

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Kombinera QD-bandet och Mikrofluidik till Monitor DNA Nanocomplex självorganisering i realtid

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Realtidsövervakning av ligand-receptor interaktion med fluorescensresonansenergiöverföring

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Övervakning plasmidreplikation i Live däggdjursceller över flera generationer genom fluorescensmikroskopi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent däggdjursceller för kontinuerlig och övervakning i realtid av cytotoxicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detektion av intracellulära genuttryck i levande celler av Murine, Mänsklig och svin användning av fluorescens-märkta Nanopartiklar

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G-proteinkopplad receptor-medierad kemotaxi och dess signaleringshändelser i neutrofil-liknande HL60-celler

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifiering av intracellulära signalerings händelser som framkallas i levande celler genom interaktion med angränsande celler genomgår apoptotisk celldöd

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Karakterisering av förkalkning händelser Använda Live Optiska och elektronmikroskopi tekniker i en marin Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation av Femtosecond laser aktiverar extracellulär-signalreglerade Kinas (ERK) signalering eller mitokondriella händelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...