Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

نشكر أوليفر فالون لمصل ضدي ضد CF1β. وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك والمنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (شرودر 617/5-1) والفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (نظم علم الأحياء FORSYS المبادرة، GoFORSYS المشروع).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لقد قدمنا ​​مؤخرا اثنين من التحسينات على نهج QUICK: خطوة يشابك لالتقاط عابرة البروتين البروتين التفاعلات (QUICK-X)، وهطول الأمطار السيطرة على تطبيع لهطول الأمطار الكفاءة غير المتساوية 6. هنا نقدم بروتوكول تحتوي على اثنين من مزيد من التحسينات QUICK: أولا، نستبدل SILAC 5 ل15 N وضع العلامات الأيضية. المزايا هي أن 15 N وضع العلامات الأيضية أرخص بكثير من SILAC، إذا تم تقديم 15 N وملح غير عضوي بسيط. وعلاوة على ذلك، يمكن مع 15 N التمثيل الغذائي يمكن تطبيق وضع العلامات السريع لبدئية لجميع الكائنات الحية الأحماض الأمينية، مثل الفطريات والبكتيريا ومعظم النباتات. وأخيرا، أرجينين إلى البرولين interconversion الأصيل في SILAC 5،6 لا يشكل مشكلة بالنسبة الكمي من 15 N المسمى الببتيدات. أمثلة لأدوات مناسبة لتقييم كمية البيانات البروتيوميات من 15 هي 12 N MSQUANT أو IOMIQS 13. الثانية، ونحن نقدم تقارب التشكيل كوسيلة للحد من وجه التحديد كمية البروتينات التي تتفاعل مع بروتين هدف معين في عينة واحدة مقابل أخرى. مزايا هذا النهج هي أن تلتف بناء المسوخ ضربة قاضية، لبعض الأنظمة التي يصعب نموذج لتوليد أو لا يمكن إنشاؤها على الإطلاق في حالة البروتينات المستهدفة الأساسية. وعلاوة على ذلك، فإنه يتجنب تفسيرات خاطئة بسبب التعبير البروتين الفرق التي تحدث كرد فعل يحتمل من الخلية إلى يطرق إلى أسفل بروتين الهدف: إذا البروتينات الأخرى أسفل التنظيم وكذلك ومع مصل ضدي تستخدم لعبور مناعي رد فعل من شأنه أن يكون تفسيرها كشركاء التفاعل الحقيقي للبروتين الهدف. في الماضي، تقارب تعديل يلغي الحاجة لإيجاد الأجسام المضادة المناسبة إلى نسبة المستضد. على الرغم من أننا لدينا لتطبيق بروتوكول reinhardtii المتلحفة والنموذج الحي، فإنه يمكن بسهولة أن تتكيف مع أي كائن الأخرى التي يمكن زراعتها في المزارع الخلوية وقادرة على استخدام نترات الأمونيوم أو كمصدر للنتروجين. قد تقارب مباشرة التشكيل مجمعات البروتين بواسطة ATP / ADP تطبيقها على المحرمين الأخرى التي تفاعل مع ركائز والبروتينات الفوج يعتمد على حالة ATP، مثل أنظمة كوصي أو GroEL/HSP60/Cpn60 HSP90 14،15، أو من أين أي نظام آخر الانتماءات الملزمة هي عن طريق التضمين ATP. وينبغي أيضا العمل تقارب التشكيل في الحالات التي يتم تغيير الانتماءات بين التفاعلات البروتين بواسطة أدوية محددة، مثل radicicol أو geldanamycin في حالة HSP90 نظم 15. وجود قيود واضحة لدينا من البروتوكول هو أنه يتطلب تقارب-تنقية أجسام مضادة ضد بروتين الهدف من المعروف أن الحساسة إلى علاج محدد / المخدرات التي ينظم تفضيله للبروتينات الشريكة. ولذلك، فليس من طريقة عالية الإنتاجية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> ProteinA sepharose و </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (ثنائي ميثيل pimelimidate) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D8388 </td><td> تخزين المجفف في -20 درجة مئوية، ويحل مباشرة قبل استخدام </td></tr><tr><td> البروتيني المثبط (كاملة، EDTA خالية) </td><td> روش العلوم التطبيقية </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> كارل روث </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> الكرياتين فوسفات </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> الكرياتين فسفوكيناز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C7886 </td><td>؛ </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [succinimidyl بروبيونات] </td><td> Sientific الحرارية </td><td> 22585 </td><td> تخزين المجفف في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> 15 NH 4 الكلورين </td><td> كامبريدج النظائر المختبرات وأندوفر، MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> LYS-C (Endoproteinase LYS-C) </td><td> روش العلوم التطبيقية </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> الخرز التربسين (Poroszyme مشلول التربسين) </td><td> النظم البيولوجية التطبيقية </td><td> 2-3127-00 </td><td> مزيج بقوة مباشرة قبل استخدام </td></tr><tr><td> Empore القرص C 18 47 ملم </td><td> فاريان </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

البروتين البروتين التفاعلات الأساسية للكثير من العمليات البيولوجية في الخلية. ولذلك، تكييفها يلعب دورا هاما في الأبحاث الحالية وعدد كبير من وسائل لتحقيقها متاح 1. البروتين البروتين التفاعلات غالبا ما تكون ديناميكية للغاية، وربما تعتمد على توطين التحت خلوية، بعد التعديلات متعدية والبيئة المحلية البروتين 2. ولذلك، ينبغي التحقيق فيها في بيئتها الطبيعية، والتي شارك في مناعي النهج هي الطريقة المفضلة 3. يتم تحديد الشركاء التفاعل المشترك عجلت إما عن طريق immunoblotting في خطوة هادفة، أو عن طريق مطياف الكتلة (LC-MS/MS) بطريقة غير مستهدفة. الاستراتيجية الأخيرة غالبا ما يتأثر سلبا من قبل عدد كبير من الاكتشافات إيجابية كاذبة، والمستمدة أساسا من حساسية عالية من الطيف الشامل الحديثة التي تكشف عن آثار بثقة unspecifically البروتينات عجل. A recenويستند النهج ر للتغلب على هذه المشكلة على فكرة أن انخفاض كميات من الشركاء معينا سوف يعمل على التفاعل المشترك مع يعجل بروتين هدف معين الخلوية التي يتم التركيز بنسبة رني، في حين أن كميات البروتينات عجل unspecifically ينبغي أن يكون تتأثر. هذا النهج، ووصف سريع لمناعي الكمية جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية 4، توظف مستقرة وصفها نظائر الأحماض الأمينية في الثقافة خلية (SILAC) 5 وMS لقياس كميات من البروتينات immunoprecipitated من سلالات البرية من نوع ونهدم. ويمكن اعتبار البروتينات الموجودة في نسبة 1:1 كما الملوثات، تلك المخصب في رواسب من نوع البرية كشركاء التفاعل محددة من البروتين الهدف. على الرغم من أن المبتكرة، QUICK يحمل بعض القيود: أولا، SILAC من حيث التكلفة مكثفة ومحدودة بالنسبة للكائنات التي هي من الناحية المثالية العوز الغذائي و / أو أرجينين يسين. النتائج interconversion وعلاوة على ذلك، عندما يتم تغذية أرجينين الثقيلة، أرجينين إلى البرولين في additIONAL الشامل لكل التحولات البرولين في الببتيد ويخفف قليلا الثقيلة مع أرجينين ضوء، مما يجعل الكمي أكثر مملة وأقل دقة 5،6. الثاني، QUICK يتطلب أن يتم معاير الأجسام المضادة بحيث لا تصبح مشبعة البروتين المستهدف في مقتطفات من ضربة إلى أسفل المسوخ. هنا نقدم بروتوكول تعديل QUICK الذي يتغلب على القيود المذكورة أعلاه من خلال استبدال QUICK SILAC لوضع العلامات 15 N التمثيل الغذائي من خلال استبدال ورني بوساطة ضرب لأسفل لتعديل النسب من البروتين البروتين التفاعلات. نبين إمكانية تطبيق هذا البروتوكول باستخدام الطحالب وحيدة الخلية الخضراء المتلحفة reinhardtii والحي النموذجي وكوصي HSP70B بلاستيدات الخضراء والبروتين الهدف 7 (الشكل 1). ومن المعروف HSP70s محددة للتفاعل مع مرافقين التعاون وركائز الدولة الوحيدة في ADP 8. نستغل هذه الخاصية كوسيلة للتحقق من معينتفاعل مع HSP70B عامل من النقد النوكليوتيدات CGE1 9.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

نقدم شكلا مختلفا للنهج QUICK (مناعي الكمية جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية) التي تم تقديمها سابقا على التمييز بين البروتين البروتين التفاعلات الصواب والخطأ. ويستند نهجنا على<sup&gt; 15N</sup&gt; وضع العلامات الأيضية، والتشكيل من الانتماءات من البروتين البروتين التفاعلات من خلال وجود / عدم وجود ATP، مناعي، والكمية مطياف الكتلة.

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

دراسة لتفاعلات البروتين البروتين في البحوث أوتوفاجي

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...