Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

Vi takker Olivier Vallon for antiserummet mod CF1β. Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systembiologi Initiative FORSYS, projektledere GoFORSYS).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Vi har for nylig introduceret to forbedringer til hurtig tilgang: en tværbindingstrin til at indfange forbigående protein-protein interaktioner (QUICK-X), og en kontrolgruppe udfældning at normalisere for ulige nedbør effektivitetsgevinster 6. Her præsenterer vi en protokol med yderligere to forbedringer af QUICK: For det første, vi udskifter SILAC 5 for 15 N metabolisk mærkning. Fordelene er, at 15 N metabolisk mærkning er meget billigere end SILAC, hvis 15N er tilvejebragt som simple uorganiske salt. Endvidere med 15 N metabolisk mærkning QUICK kan anvendes på organismer prototrofe for alle aminosyrer, som de fleste planter, svampe og bakterier. Og endelig ser arginin-til-prolin interomdannelse forbundet til SILAC 5,6 ikke et problem for kvantificering af 15 N mærkede peptider. Eksempler på egnede redskaber til den kvantitative evaluering af 15 N proteomics data er MSQUANT 12 eller jegOMIQS 13. For det andet introducerer vi affinitet modulation som et middel til specifikt at reducere mængden af ​​proteiner, der interagerer med et bestemt målprotein i en prøve versus en anden. Fordelene ved denne tilgang er, at den omgår konstruktionen af ​​knockdown-mutanter, hvilket for nogle modelsystemer er vanskelige at frembringe eller ikke kan frembringes på alle ved væsentlige målproteiner. Desuden er det undgår fejlfortolkninger forårsaget af forskellen proteinekspression potentielt opstår som reaktion af cellen for banker-down et målprotein: hvis andre proteiner er nedreguleret samt og krydsreagerer med antiserum anvendt til immunopræcipitation, ville de blive fortolket som ægte interaktion partnere af målproteinet. Til sidst ophæver affinitet modulation nødvendigheden af ​​at finde en passende antistof-til-antigen-forhold. Selvom vi anvender vores protokol til Chlamydomonas reinhardtii som model organismeKan det let tilpasses enhver anden organisme, der kan dyrkes i cellekultur og kan anvende ammonium eller nitrat som nitrogenkilde. Affinity modulation af proteinkomplekser af ATP / ADP kan direkte anvendes på andre chaperoner, hvis interaktion med substrater og kohorte proteiner afhænger af ATP tilstand, ligesom de GroEL/HSP60/Cpn60 eller HSP90 chaperone systemer 14,15, eller ethvert andet system, hvor bindingsaffiniteter moduleres af ATP. Affinity graduering bør også arbejde for de tilfælde, hvor slægtskab mellem protein interaktioner er ændret ved specifikke lægemidler, såsom radicicol eller geldanamycin i tilfælde af HSP90 systemer 15. En klar begrænsning af vores protokol, er at det kræver affinitetsoprensede antistoffer mod et målprotein kendt for at være følsomt over for en specifik behandling / lægemiddel, som modulerer dets affinitet for partner proteiner. Det er derfor ikke high-throughput metode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfrit) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimethyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Opbevar udtørret ved -20 ° C, opløses umiddelbart før brug </td></tr><tr><td> Proteaseinhibitor (komplet, EDTA-fri) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinphosphat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27.920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatininfosfokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [succinimidylpropionat] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22.585 </td><td> Opbevares tørret ved 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH4Cl </td><td> Cambridge isotoplaboratorier, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin beads (Poroszyme immobiliseret trypsin) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Bland kraftigt umiddelbart før brug </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Protein-protein interaktioner er afgørende for mange biologiske processer i cellen. Derfor bør deres karakterisering spiller en vigtig rolle i den aktuelle forskning og et væld af metoder til deres undersøgelse er tilgængelig 1. Protein-protein-interaktioner ofte er meget dynamisk og kan afhænge af subcellulær lokalisering, post-translationelle modifikationer og det lokale protein miljø 2. Derfor bør de blive undersøgt i deres naturlige miljø, hvor co-immunoudfældning metoder er den foretrukne metode 3. Co-udfældede interaktion partnere identificeres enten ved immunoblotting med en målrettet fremgangsmåde, eller ved massespektrometri (LC-MS/MS) i en ikke-målrettede måde. Sidstnævnte strategi ofte er negativt påvirket af et stort antal falske positive opdagelser, primært stammer fra den høje følsomhed af moderne massespektrometre, der trygt afsløre spor af uspecifikt fældningsreagenset proteiner. En recent metode til at overvinde dette problem er baseret på idéen om, at nedsatte mængder af specifikke interaktion partnere vil co-bundfald med et givet målprotein, hvis cellulære koncentration reduceres med RNAi, mens mængderne af uspecifikt udfældende proteiner bør være uberørt. Denne fremgangsmåde, der betegnes QUICK til kvantitativ Immunoprecipitation Kombineret med Knockdown 4, beskæftiger Stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) 5 og MS at kvantificere mængderne af proteiner immunpræcipiteret fra vildtype-og knock-down stammer. Proteiner fundet i et 1:1-forhold kan betragtes som kontaminanter, de beriget udfældes fra vildtypen som specifikke interaktion partnere af målproteinet. Selv innovative, QUICK bærer nogle begrænsninger: for det første, SILAC er omkostningskrævende og begrænset til organismer, der ideelt set er auxotrofe for arginin og / eller lysin. Når endvidere tunge arginin tilføres, arginin-til-prolin omdannelse resulterer i additional masse skift for hver prolin i et peptid og lidt fortynder tunge med lys arginin, hvilket gør kvantificering mere trættende og mindre nøjagtig 5,6. Sekund, QUICK kræver, at antistoffer titreres, således at de ikke bliver mættet med målprotein i ekstrakter fra knock-down mutanter. Her introducerer vi en modificeret QUICK protokol, som overvinder de ovennævnte begrænsninger QUICK ved at erstatte SILAC for 15 N metabolisk mærkning og ved at erstatte RNAi-medieret knock-down for affinitet graduering af protein-protein interaktioner. Vi viser anvendeligheden af denne protokol ved hjælp af de encellede grønalge Chlamydomonas reinhardtii som model organisme og kloroplast HSP70B chaperone som målprotein 7 (figur 1). HSP70s er kendt for at interagere med specifikke co-chaperoner og substrater kun i ADP tilstand 8. Vi udnytter denne egenskab som et middel til at verificere de specifikkeinteraktion af HSP70B med dens nucleotid udveksling faktor CGE1 9.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Vi præsenterer en variation af QUICK (kvantitative Immunoprecipitation Kombineret med Knockdown) tilgang, der blev indført tidligere at skelne mellem sande og falske protein-protein interaktioner. Vores tilgang er baseret på<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolisk mærkning, moduleringen af ​​affiniteter af protein-protein-interaktioner ved tilstedeværelsen / fraværet af ATP, immunpræcipitation, og kvantitativ massespektrometri.

En protokol til identifikation af protein-protein interaktioner Udfra<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk mærkning Immunoprecipitation, Kvantitativ massespektrometri og Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

En ny tilgang til en sammenlignende analyse af multiprotein komplekser Baseret på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk mærkning og kvantitativ massespektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersøgelse af protein-protein interaktioner i levende celler Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunpræcipitation Assay til identifikation af Arabidopsis Protein-DNA interaktioner<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identifikation af MyoD Interactome Brug Tandem Affinity Rensning Koblet til massespektrometri

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Undersøgelse af Protein-protein interaktioner i Autophagy forskning

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantificering af lokationsspecifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometrisk ved hjælp af Data-uafhængig erhvervelse massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...