Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

Wij danken Olivier Vallon voor het antiserum tegen CF1β. Dit werk werd ondersteund door het Max Planck Instituut en subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, project GoFORSYS).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben onlangs twee verbeteringen aan de QUICK aanpak: een verknopingsstap voor het vastleggen van voorbijgaande eiwit-eiwit interacties (QUICK-X), en een controle-precipitatie te normaliseren voor ongelijke neerslag efficiëntie 6. Hier hebben we een protocol met de twee andere verbeteringen van QUICK presenteren: ten eerste, vervangen we SILAC 5 voor 15 N metabolische labeling. De voordelen zijn dat 15 N metabolische labeling is veel goedkoper dan SILAC als 15 N wordt verschaft als eenvoudige anorganische zout. Bovendien met 15 N metabolische labeling QUICK kan op organismen prototrofisch voor alle aminozuren, zoals de meeste planten, schimmels en bacteriën. Slotte kan arginine naar proline interconversie inherent aan SILAC 5,6 geen probleem voor de kwantificering van 15 N gemerkte peptiden. Voorbeelden van geschikte instrumenten voor de kwantitatieve evaluatie van 15 N proteomics data zijn MSQUANT 12 of IOMIQS 13. Tweede introduceren wij affiniteit modulatie als middel voor specifiek reduceren van de hoeveelheid eiwitten interageren met een bepaald doeleiwit in een monster versus andere. De voordelen van deze benadering zijn dat de constructie van knockdown mutanten, die om modelsystemen moeilijk te genereren of kunnen worden gegenereerd om alle om wezenlijke doeleiwitten omzeilt. Bovendien voorkomt misverstanden door differentiële eiwitexpressie mogelijk gebeurt als reactie van de cel te kloppen-down een doeleiwit: als andere eiwitten downgereguleerd ook en kruisreageren met het antiserum voor immunoprecipitatie, zouden ze worden uitgelegd als echte interactiepartners van het doeleiwit. Tenslotte affiniteit modulatie maakt het overbodig vinden van een goede antilichaam-antigen to-ratio. Hoewel we passen onze protocol om Chlamydomonas reinhardtii als modelorganismeKan gemakkelijk worden aangepast aan andere organismen die kunnen worden gekweekt in celkweek en kan ammonium of nitraat als stikstofbron. Affiniteit modulatie van eiwitcomplexen door ATP / ADP kan direct worden toegepast op andere chaperones waarvan de wisselwerking met substraten en eiwitten cohort afhankelijk van de ATP toestand, zoals HSP90 of GroEL/HSP60/Cpn60 chaperone systemen 14,15, of andere systemen waarbij bindingsaffiniteiten worden gemoduleerd door ATP. Affinity modulatie ook werken wanneer verwantschap tussen eiwitinteracties worden gewijzigd door specifieke geneesmiddelen, zoals geldanamycine radicicol of bij HSP90 systemen 15. Een duidelijke beperking van ons protocol is dat het vereist affiniteitsgezuiverde antilichamen tegen een doeleiwit bekend is gevoelig voor een specifieke behandeling / geneesmiddel dat zijn affiniteit voor eiwitten partner moduleert. Daarom is geen high-throughput methode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimethyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Bewaar gedroogde bij -20 ° C, direct te ontbinden voor gebruik </td></tr><tr><td> Proteaseremmer (complete, EDTA-vrij) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinefosfaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinefosfokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP dithiobis [succinimidylpropionaat] </td><td> Thermo sientific </td><td> 22585 </td><td> Bewaar gedroogde bij 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isotopenlaboratoria, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteïnase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine beads (Poroszyme Geïmmobiliseerde trypsine) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Meng krachtig direct voor gebruik </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Eiwit-eiwit interacties zijn essentieel voor vele biologische processen in de cel. Derhalve hun karakterisering speelt een belangrijke rol in lopend onderzoek en een overvloed van werkwijzen voor hun onderzoek beschikbaar 1. Eiwit-eiwit interacties vaak zeer dynamisch en kan afhangen van subcellulaire lokalisatie, post-translationele modificaties en de lokale omgeving eiwit 2. Daarom moeten ze worden onderzocht in hun natuurlijke omgeving, waarbij co-immunoprecipitatie bevorderen, de voorkeursmethode 3. Gecoprecipiteerde interactiepartners worden ofwel door immunoblotting in een gerichte benadering of door massaspectrometrie (LC-MS/MS) in een ongerichte wijze. De laatste strategie wordt vaak negatief beïnvloed door een groot aantal fout-positieve ontdekkingen, voornamelijk afkomstig van de hoge gevoeligheid van de moderne massaspectrometers die vol vertrouwen te sporen sporen van niet-specifiek precipiterende eiwitten. Een recent benadering voor dit probleem is gebaseerd op het idee dat verlaagde hoeveelheden van specifieke interactiepartners zal co-precipitaat met een bepaald doeleiwit waarvan cellulaire concentratie verminderd RNAi, terwijl de hoeveelheid niet-specifiek neerslaan eiwitten worden beïnvloed. Deze aanpak, genaamd QUICK voor kwantitatieve Immunoprecipitatie In combinatie met Knockdown 4, telt stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur (SILAC) 5 en de lidstaten om de hoeveelheden eiwitten immunogeprecipiteerd van wild-type en knock-down stammen te kwantificeren. Eiwitten in een verhouding van 1:1 kan worden beschouwd als verontreinigingen, die verrijkt in precipitaten van de wildtype als specifieke interactiepartners van het doeleiwit. Hoewel innovatieve, QUICK draagt ​​een aantal beperkingen: ten eerste, SILAC is dure en beperkt tot organismen die ideaal zijn auxotrofe voor arginine en / of lysine. Bovendien, wanneer zware arginine wordt toegevoerd, arginine naar proline interconversie resultaten additional massa verschuivingen voor elke proline in een peptide en licht verdunt zware met lichte arginine, waardoor kwantificering meer vervelend en minder nauwkeurig 5,6. Ten tweede, vereist dat antilichamen worden getitreerd zodat zij niet verzadigd met doeleiwit in extracten van knock-down mutanten. Hier we een gemodificeerde QUICK protocol dat bovengenoemde beperkingen van QUICK door vervanging SILAC 15 N metabolische labeling en vervangen RNAi-gemedieerde knock-down voor affiniteit modulatie van eiwit-eiwit interacties overwint. We tonen de toepasbaarheid van dit protocol met de eencellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii als modelorganisme en de chloroplast HSP70B chaperonne als doeleiwit 7 (figuur 1). HSP70s is bekend interageren met specifieke co-chaperones en substraten alleen in staat ADP 8. We benutten deze eigenschap als een middel om de specifieke te controlereninteractie van HSP70B met nucleotide exchange factor CGE1 9.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd op<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolische labeling, de modulatie van affiniteiten van eiwit-eiwit interacties door de aanwezigheid / afwezigheid van ATP, immunoprecipitatie en kwantitatieve massaspectrometrie.

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...