Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

אנו מודים לאוליבייה Vallon antiserum נגד CF1β. עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק ומענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (Schr 617/5-1) וBundesministerium für Bildung und Forschung (FORSYS הביולוגיה המערכתית יוזמה, GoFORSYS פרויקט).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

יש לנו הצגנו לאחרונה שני שיפורים לגישה המהירה: צעד crosslinking ללכידת אינטראקציות בין חלבונים חולפות (QUICK-X), ומשקעי שליטה לנרמל ליעילות משקעים שווה 6. כאן אנו מציגים פרוטוקול המכיל עוד שני שיפורים של מהיר: ראשון, אנחנו להחליף SILAC 5 עבור 15 N תיוג מטבולית. היתרונות הם כי 15 N תיוג מטבולית הם הרבה יותר זול מאשר SILAC, אם 15 N מסופק כמלח אורגני פשוט. יתר על כן, עם 15 N מטבולית תיוג מהיר יכול להיות מיושם על prototrophic אורגניזמים לכל החומצות האמינו, כמו רוב הצמחים, פטריות וחיידקים. ולבסוף, interconversion הטבוע SILAC 5,6 ארגינין לפרולין אינו מהווה בעיה לכימות של 15 N מתויג פפטידים. דוגמאות לכלים מתאימים להערכה כמותית של 15 נתוני N proteomics הן 12 MSQUANT אוOMIQS 13. שנית, אנחנו מציגים את זיקת אפנון כאמצעי להפחתת כמות החלבונים באינטראקציה עם חלבון המטרה הניתן בדגימה אחת לעומת אחרת במפורש. היתרונות של גישה זו הם שהוא עוקף את הבנייה של מוטציות, שמציאה עבור כמה מערכות מודל קשה לייצר או לא יכול להיות שנוצרו בכל במקרה של חלבוני היעד חיוניים. יתר על כן, הוא נמנע מפרשנויות מוטעות הנגרמות על ידי ביטוי חלבון הפרש פוטנציאלי המתרחש כתגובה של התא לדפיקות למטה חלבון מטרה: אם חלבונים אחרים הם מוסדר כלפי מטה, כמו גם ולחצות-מגיבים עם antiserum משמש לimmunoprecipitation, הם יתפרשו כשותפים אמיתיים של אינטראקציה של חלבון המטרה. לבסוף, זיקת אפנון מבטל את הצורך של מציאת יחס נכון נוגדן לאנטיגן. למרות שאנחנו מיישמים הפרוטוקול שלנו לreinhardtii Chlamydomonas כאורגניזם מודל, זה יכול בקלות להיות מותאם לכל אורגניזם אחר שניתן לגדל בתרבית תאים, והוא מסוגל להשתמש באמוניום חנק או כמקור חנקן. אפנון זיקה של קומפלקסי חלבונים על ידי ATP / ADP ישירות עשוי להיות מיושם למלווים אחרים שאינטראקציה עם מצעים וחלבוני עוקבה תלויה במצב ATP, כמו GroEL/HSP60/Cpn60 או Hsp90 מערכות מלווה 14,15, או לכל מערכת אחרת שבי זיקות מחייבות הם מווסתים על ידי ATP. זיקת אפנון צריך גם לעבוד למקרים בם זיקות בין אינטראקציות חלבון שונו על ידי תרופות מסוימות, כגון radicicol או geldanamycin במקרה של Hsp90 מערכות 15. מגבלה ברורה של הפרוטוקול שלנו היא שזה דורש זיקה-מטוהרי נוגדנים נגד חלבון המטרה הידועה להיות רגיש לטיפול / תרופה שמודולציה זיקתו לחלבוני שותפים ספציפיים. לכן, אין זה שיטת תפוקה גבוהה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (דימתיל pimelimidate) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D8388 </td><td> אחסן מיובש ב -20 ° C, לפזר ישירות לפני השימוש </td></tr><tr><td> פרוטאז מעכב (מלא, ללא EDTA) </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> קרל רוט </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> קריאטין פוספאט </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> phosphokinase קריאטין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [succinimidyl propionate] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> אחסן מיובש ב 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ מעבדות, אנדובר, מסצ&#39;וסטס </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי טריפסין (Poroszyme ללא יכולת לזוז, טריפסין) </td><td> אפלייד Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> מערבב נמרצות ישירות לפני השימוש </td></tr><tr><td> דיסק Empore 18 C 47 מ&quot;מ </td><td> ריאן </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

אינטראקציות בין חלבונים הן בסיסיות לתהליכים ביולוגיים רבים בתא. לכן, האפיון שלהם ממלא תפקיד חשוב במחקר נוכחי ושפע של שיטות לחקירה שלהם זמינה 1. אינטראקציות בין חלבונים לעתים קרובות הן מאוד דינמיות ויכולות להיות תלויות בלוקליזציה subcellular, שינויים שלאחר translational וסביבת החלבון המקומית 2. לכן, הם צריכים להיחקר בסביבה הטבעית שלהם, שלגישות שיתוף immunoprecipitation הן שיטת הבחירה 3. שותפי אינטראקצית שיתוף זרזו מזוהים או על ידי immunoblotting בגישה ממוקדת, או על ידי ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS) באופן לא ממוקד. האסטרטגיה האחרונה לעתים קרובות מושפעת לרעה על ידי מספר גדול של תגליות חיוביות כוזבות, נבע בעיקר מהרגישות הגבוהה של ספקטרומטרים המונים מודרניים שבביטחון לזהות עקבות של חלבונים מזרזים unspecifically. Recenגישה לא להתגבר על בעיה זו מבוססת על הרעיון שסכומים מופחתים של שותפי אינטראקציה ספציפיים יהיו שותף במשקע עם חלבון המטרה נתונה שריכוז סלולרי הוא מופחת על ידי RNAi, ואילו הסכומים של חלבונים מזרזים unspecifically צריכים להיות מושפעים. גישה זו, המכונית מהירה לimmunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה 4, מעסיקה תיוג יציב האיזוטופי של חומצות אמינו בתרבית תאים (SILAC) 5 ו-MS לכמת את הכמויות של חלבוני immunoprecipitated מזנים פראיי סוג ועקום למטה. חלבונים הנמצאים בליחס של 1:1 יכולים להיחשב כמזהמים, אלה מועשרים במשקעים מהסוג הפראי כשותפי אינטראקציה ספציפיות של חלבון המטרה. אמנם חדשני, מהיר נושא מספר מגבלות: ראשית, SILAC הוא העלות אינטנסיבית ומוגבל לאורגניזמים שהם אידיאליים לauxotrophic ארגינין ו / או ליזין. תוצאות interconversion יתר על כן, כאשר ארגינין כבד נזון, ארגינין ל-פרולין בadditמסת ional המשמרות עבור כל פרולין בפפטיד ומעט מדללת כבד עם ארגינין אור, מה שהופך את הכימות יותר משעמם ופחות מדויק 5,6. שנית, מהיר דורש כי נוגדני טיטרציה כך שהם אינם הופכים רוויים בחלבון המטרה בתמציות מעקומות למטה מוטציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מהיר שונה המתגבר על המגבלות האמורות לעיל מהיר על ידי החלפת SILAC תיוג 15 N חילוף חומרים ועל ידי החלפת RNAi בתיווך עקום למטה לאפנון זיקה של אינטראקציות בין חלבונים. אנחנו מדגימים את הישימות של פרוטוקול זה באמצעות Chlamydomonas האצה הירוק unicellular reinhardtii כאורגניזם מודל ומלווה HSP70B הכלורופלסט כחלבון המטרה 7 (איור 1). HSP70s ידוע לאינטראקציה עם עמיתים למלווי מצעים רק במדינת ADP 8 ספציפיים. אנו מנצלים נכס זה כאמצעי לאימות ספציפיתאינטראקציה של HSP70B עם גורם חילופי נוקלאוטיד 9 CGE1.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת על<sup&gt; 15N</sup&gt; תיוג מטבולית, האפנון של זיקות של אינטראקציות בין חלבונים על ידי הנוכחות / היעדרות של ה-ATP, immunoprecipitation, וספקטרומטריית מסה כמותית.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...