Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
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Ringraziamo Olivier Vallon per l&#39;antisiero contro CF1β. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society e sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (la biologia dei sistemi FORSYS iniziativa, GoFORSYS progetto).

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo recentemente introdotto due miglioramenti del metodo VELOCE: una fase di reticolazione per catturare transitori interazioni proteina-proteina (QUICK-X), e la precipitazione di controllo di normalizzare l&#39;efficienza precipitazioni disuguali 6. Qui vi presentiamo un protocollo contenente due miglioramenti in più di RAPIDO: in primo luogo, si sostituisce SILAC 5 per 15 N marcatura metabolica. I vantaggi sono che 15 N marcatura metabolica è molto più economico rispetto SILAC, se 15 N viene fornito come semplice sale inorganico. Inoltre, con 15 N metabolica etichettatura RAPIDO può essere applicato a prototrofici organismi per tutti gli aminoacidi, come la maggior parte delle piante, funghi e batteri. E infine, arginina-to-prolina interconversione inerente SILAC 5,6 non rappresenta un problema per la quantificazione di 15 N peptidi marcati. Esempi di strumenti idonei per la valutazione quantitativa di 15 proteomica N dati sono 12 MSQUANT o IOMIQS 13. In secondo luogo, si introduce affinità modulazione come mezzo per specificatamente ridurre la quantità di proteine ​​che interagiscono con una proteina bersaglio in un dato campione rispetto all&#39;altro. I vantaggi di questo approccio sono che aggira la costruzione di mutanti knockdown, che per alcuni sistemi modello sono difficili da generare o non può essere generato affatto in caso di proteine ​​bersaglio essenziali. Inoltre, evita fraintendimenti dovuti espressione differenziale proteine ​​potenzialmente presenti come una risposta della cellula a bussare-giù una proteina bersaglio: se altre proteine ​​sono down-regolati come bene e cross-reagiscono con l&#39;antisiero utilizzato per immunoprecipitazione, verrebbero interpretati come partner vera interazione della proteina bersaglio. Finalmente, affinità modulazione sopprime la necessità di trovare un buon anticorpo antigene-to-rapporto. Anche se applichiamo il nostro protocollo di Chlamydomonas reinhardtii come organismo modello, Può essere facilmente adattato a qualsiasi altro organismo che può essere coltivata in coltura cellulare ed è in grado di utilizzare o nitrato di ammonio come fonte di azoto. Modulazione affinità di complessi proteici da ATP / ADP può essere direttamente applicato ad altri accompagnatori cui interazione con i substrati e proteine ​​coorte dipende dallo stato ATP, come i sistemi GroEL/HSP60/Cpn60 o HSP90 chaperone 14,15, o qualsiasi altro sistema in cui affinità di legame sono modulate da ATP. Affinità modulazione dovrebbe funzionare anche per i casi in cui sono alterati affinità tra le interazioni proteina da farmaci specifici, come radicicol geldanamicina o nel caso di sistemi Hsp90 15. Un limite evidente di questo protocollo è che richiede purificati per affinità di anticorpi contro una proteina bersaglio noto per essere sensibili ad un trattamento specifico / farmaco che modula la sua affinità per le proteine ​​partner. Pertanto, non è elevato throughput metodo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Proteina Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Conservare essiccato a -20 ° C, sciogliere direttamente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi (completo, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenosina-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Creatina fosfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfochinasi creatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP ditiobis [succinimidil propionato] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> Conservare essiccato a 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isotopo laboratori, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinasi Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina perline (Poroszyme Immobilized tripsina) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Mescolare energicamente direttamente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 millimetri disco </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Interazioni proteina-proteina sono fondamentali per molti processi biologici nella cellula. Pertanto, la loro caratterizzazione svolge un ruolo importante nella ricerca attuale e una pletora di metodi per la loro indagine è disponibile 1. Interazioni proteina-proteina sono spesso altamente dinamico e potrebbe dipendere localizzazione subcellulare, modificazioni post-traduzionali di proteine ​​e dell&#39;ambiente locale 2. Pertanto, essi devono essere esaminati nel loro ambiente naturale, per cui co-immunoprecipitazione approcci sono il metodo di scelta 3. Co-precipitate partner di interazione sono identificati mediante immunoblotting in un approccio mirato, o spettrometria di massa (LC-MS/MS) in modo non mirati. Quest&#39;ultima strategia spesso è influenzata negativamente da un gran numero di falsi positivi scoperte, derivano principalmente dalla sensibilità di moderni spettrometri di massa che con sicurezza rilevare tracce di aspecifico proteine ​​precipitanti. A Recent approccio per superare questo problema si basa sull&#39;idea che ridotte quantità di partner di interazione specifici sarà co-precipitato con una proteina bersaglio in cui la concentrazione cellulare è diminuito di RNAi, mentre le quantità di proteine ​​aspecifico precipitanti dovrebbe essere influenzata. Questo approccio, chiamato VELOCE per immunoprecipitazione quantitativi combinazione con atterramento 4, impiega Etichettatura degli isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) 5 e MS per quantificare la quantità di proteine ​​immunoprecipitate da ceppi wild-type e knock-down. Proteine ​​che si trovano in un rapporto di 1:1 può essere considerata come contaminanti, tali arricchito in precipitati dal tipo selvaggio come partner di interazione specifici della proteina bersaglio. Anche se innovativo, QUICK porta alcune limitazioni: in primo luogo, SILAC è costosa e limitata per gli organismi che idealmente sono auxotrophic per arginina e / o lisina. Risultati di interconversione Inoltre, quando viene alimentato arginina pesante, arginina-to-prolina in additmassa ional sposta per ciascun prolina in un peptide e diluisce leggermente pesante con arginina luce, che rende la quantificazione più noioso e meno accurato 5,6. Secondo, VELOCE richiede che gli anticorpi vengono titolati in modo tale che essi non si satura con proteina bersaglio in estratti di knock-down mutanti. Qui vi presentiamo un protocollo modificato VELOCE che supera i limiti di cui sopra, con Quick sostituendo SILAC per l&#39;etichettatura 15 N metabolica e sostituendo RNAi mediato knock-down per la modulazione affinità di interazioni proteina-proteina. Dimostriamo l&#39;applicabilità del protocollo in base alle unicellulari Chlamydomonas verde alga reinhardtii come organismo modello e il tuttofare HSP70B cloroplasto come proteina bersaglio 7 (Figura 1). HSP70s sono noti per interagire con specifiche co-accompagnatori e substrati solo nello stato ADP 8. Sfruttiamo questa proprietà come mezzo per verificare la specificainterazione di HSP70B con il suo fattore di scambio nucleotidico CGE1 9.

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Vi presentiamo una variante del RAPIDO (immunoprecipitazione quantitativi combinazione con smontabile), approccio che è stato introdotto in precedenza per distinguere tra vero e falso interazioni proteina-proteina. Il nostro approccio è basato sulla<sup&gt; 15N</sup&gt; Marcatura metabolica, la modulazione di affinità di interazioni proteina-proteina dalla presenza / assenza di ATP, immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

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