Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
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我々はCF1βに対する抗血清に対してオリビエヴァロンに感謝します。この作品は、マックス·プランク協会とドイツ学術振興（SCHR 617/5-1）とBundesministeriumエリーゼのためBildung undのForschung（システムバイオロジーイニシアティブFORSYS、プロジェクトGoFORSYS）からの補助金によって支えられている。

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

一過性のタンパク質-タンパク質相互作用（QUICK-X）を捕捉するための架橋工程、及び不平等降水効率6を標準化するための制御降水量：我々は最近、2つの簡単なアプローチへの改良を導入しています。ここでは、クイックの2以上の改善が含まれているプロトコル提示します：最初に、我々は、15 Nの代謝標識用SILAC 5を交換してください 。利点は、15 Nは単純な無機塩として提供されている場合は、15 N代謝標識は、SILACよりもはるかに安価であるということです。更に、早い15 N代謝標識で最も植物、菌類やバクテリアのように、すべてのアミノ酸のための生物の原栄養に適用することができます。そして最後に、SILAC 5,6に固有アルギニン·ツー·プロリン相互変換は、15 N標識ペプチドの定量化のための問題を提示しません。 15 Nプロテオミクスデータを定量的に評価するのに適したツールの例としては、12アールMSQUANTまたはIOMIQS 13。 第二に、我々は、特に別の対つのサンプル内の指定された標的タンパク質と相互作用するタンパク質の量を減らすための手段として、親和性の変調をご紹介します。このアプローチの利点は、それはいくつかのモデル·システムのために生成することが困難であるか、すべての本質的な標的タンパク質の場合では生成されませんノックダウン変異体の建設を回避することである。また、それは潜在的に標的タンパク質をノックダウンに対する細胞の応答として発生する差動タンパク質発現によって引き起こされる誤解を避けることができます他のタンパク質も同様にダウンレギュレートされ、免疫沈降に使用する抗血清と交差反応するなら、それらは解釈されてしまう標的タンパク質の真の相互作用パートナーとして。最後に、親和性の変調は、適切な抗体に抗原比を見つけることの必要性を消失させる。 我々は、モデル生物としてクラミドモナスに我々のプロトコルを適用していますが、それは容易に細胞培養で増殖させ、窒素源としてアンモニアや硝酸を使用することができますすることができる任意の他の生物に適応させることができます。 ATP / ADPによるタンパク質複合体の親和性は、直接変調GroEL/HSP60/Cpn60またはHSP90シャペロンシステム14,15のように、場所や他のシステムに、その相互作用基質およびコホートタンパク質とATPの状態に依存する他のシャペロンにも適用することができる結合親和性は、ATPによって変調される。親和性調節は、タンパク質間相互作用の間の親和性は、HSP90システム15の場合ラディシコールまたはゲルダナマイシンのような特定の薬によって変更される場合のために働く必要があります。 我々のプロトコルの明確な制限は、パートナータンパク質に対する親和性を調節する特定の治療/薬物に敏感であることが知られている標的タンパク質に対してアフィニティー精製抗体を必要とするということです。したがって、それはハイスループット法ではありません。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>プロテインAセファロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP（ジメチルpimelimidate） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D8388 </td><td> -20℃で乾燥保管し、使用する前に直接溶かす</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤（完全、EDTAを含まない） </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP（アデノシン-5&#39;-triphosphat） </td><td>カール·ロート</td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td>クレアチンリン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSPジチオビス[スクシンイミジルプロピオネート] </td><td> Sientificサーモ</td><td> 22585 </td><td> 4で乾燥℃で保存</td></tr><tr><td> 15 NH 4 Clを </td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ、アンドーバー、マサチューセッツ州</td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td>のLys-C（エンドプロテイナーゼ のLys-C） </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシンビーズ（Poroszymeはトリプシンを固定化） </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 2-3127-00 </td><td>直接使用する前に、精力的に混ぜる</td></tr><tr><td> C 18 47ミリメートルディスクをEmpore </td><td>バリアン</td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

タンパク質 - タンパク質相互作用は、細胞内の多くの生物学的プロセスのための基本となります。したがって、それらの特性は、現在の研究に重要な役割を果たしており、その調査のための方法の茄多が1利用可能です。タンパク質-タンパク質相互作用は、しばしば非常に動的であり、細胞内局在、翻訳後修飾と局所的なタンパク質の環境2に依存するかもしれません。したがって、これらは共免疫沈降アプローチは選択肢3の方法であるため、それらの自然環境の中で検討すべきである。共沈相互作用パートナーが関連性の低い方法でターゲットを絞ったアプローチで、または質量分析（LC-MS/MS）によるイムノブロッティングのいずれかで識別されています。後者の戦略は、しばしば悪影響を自信を持って、主に非特異的にタンパク質を沈殿させるの痕跡を検出現代の質量分析計の高感度に由来する偽陽性発見、大量の数に影響されます。 recenこの問題を克服するためのtのアプローチが考えに基づいている非特異的に沈殿するタンパク質の量は影響を受けなければならないときに、特定の相互作用パートナーの減少量は、細胞内濃度RNAiにより低減され与えられた標的タンパク質と共沈すること。このアプローチは、ノック4と組み合わせることで定量的な免疫沈降のためのクイックと呼ばれる野生型およびノックダウン株から免疫沈降したタンパク質の量を定量化するための安定同位体細胞培養におけるアミノ酸のラベリング（SILAC）5とMSを採用しています。 1:1の比率で見つかったタンパク質は、汚染物質、標的タンパク質の特異的な相互作用パートナーとして野生型から沈殿に富んだものとみなすことができる。革新が、QUICKは、いくつかの制限を負います：まず最初に、SILACはコストがかかり、理想的にはアルギニン及び/またはリジン要求性である生物に制限されています。 ADDITでまた、重いアルギニンが供給され、アルギニンからプロリン相互変換の結果ペプチドの各プロリンionalマスのシフトと若干5,6定量がもっと退屈であまり正確になり光アルギニン、と重い薄め。第二に、QUICKは、抗体は、彼らがノックダウン変異体からの抽出物中の標的タンパク質で飽和しないように滴定されている必要があります。 ここでは、15 Nの代謝標識用SILACを置き換えることにより、タンパク質-タンパク質相互作用の親和性の変調のためにRNAiによるノックダウンを置き換えることにより、QUICK上記の限界を克服する修正されたクイックプロトコルを紹介します。我々は、単細胞緑藻クラミドモナスのモデル生物と標的タンパク質7（ 図1）のような葉緑体HSP70Bシャペロンとしてクラミドモナス使用して、このプロトコルの適用性を実証する。 HSP70sのみのADP状態8で特定の共同シャペロンと基質と相互作用することが知られている。我々は、特定性を確認する手段として、この性質を利用そのヌクレオチド交換因子CGE1 9とHSP70Bの相互作用。

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

私たちは、真と偽のタンパク質 - タンパク質相互作用を区別する以前に導入されたクイック（ノックダウンと組み合わせる定量免疫沈降）アプローチのバリエーションを提示します。私たちのアプローチはに基づいている<sup&gt; 15N</sup&gt;代謝標識ATPの存在/不在によるタンパク質 - タンパク質相互作用の親和性の調節、免疫沈降、および定量的質量分析。

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

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