Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
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우리는 CF1β에 대한 항혈청을위한 올리비에 Vallon 감사드립니다. 이 작업은 최대 플랑크 사회와 독일 Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1)와 Bundesministerium 털 Bildung 숙녀 Forschung (시스템 생물 이니셔티브 FORSYS, 프로젝트 GoFORSYS)에서 보조금에 의해 지원되었다.

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	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

과도 단백질 단백질 상호 작용 (QUICK-X)를 캡처하기위한 crosslinking 단계, 그리고 불평등 침전 효율 6 정상화 할 수있는 제어 강수량 : 우리는 최근 QUICK 방법 두 가지 개선을 도입했습니다. 다음은 QUICK의 두 개선이 포함 된 프로토콜 제시 : 먼저, 우리는 15 N 신진 대사 라벨링에 대한 SILAC 5 바꿉니다. 장점은 15 N은 단순 무기 소금으로 제공되는 경우 15 N 신진 대사 라벨이 SILAC보다 훨씬 저렴하다고합니다. 또한, 15 N 신진 대사와 QUICK 라벨 대부분의 식물, 곰팡이 및 박테리아처럼, 모든 아미노산에 대한 생물의 prototrophic에 적용 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, SILAC 5,6에 내재 아르기닌 - 투 - 프롤린 interconversion 15 N이라는 펩티드의 정량화에 대한 문제를 제시하지 않습니다. 15 N의 단백질 체학 데이터의 양적 평가에 적합한 도구 예를 들면 MSQUANT 12 I 아르OMIQS 13. 둘째, 우리는 특별히 다른 비해 한 샘플에서 주어진 목표 단백질과 상호 작용하는 단백질의 양을 감소시키기위한 수단으로 친화력 변조를 소개합니다. 이 방법의 장점은 일부 모델 시스템을 생성하기가 어렵습니다 또는 모든 필수 대상 단백질의 경우에서 생성 할 수없는 최저의 돌연변이의 건설을 circumvents한다는 점입니다. 또한, 잠재적 대상 단백질을 쓰러 뜨린에 세포의 응답으로 발생하는 차동 단백질 발현에 의한 misinterpretations을 방지 : 다른 단백질뿐만 아니라 다운 규제하고 immunoprecipitation에 사용 된 항혈청과 교차 반응하는 경우, 그들은 해석 될 대상 단백질의 진정한 상호 작용 파트너 있습니다. 마지막으로, 화성 변조는 적절한 항체 - 투 - 항원 비율을 찾는 필요성을 시킨다는. 우리는 모델 생물로 Chlamydomonas reinhardtii의 우리의 프로토콜을 적용되지만, 그것은 쉽게 세포 배양에서 재배 및 질소 소스로 암모니아 또는 질산을 사용 할 수 있습니다 할 수있는 다른 생물체에 적용 할 수 있습니다. ATP / ADP에 의한 단백질 단지의 연관성 변조는 직접 GroEL/HSP60/Cpn60 또는 HSP90 자야 시스템 14,15 같은 그의 상호 작용 기판과 일대 단백질과 ATP 상태에 따라 다른 보호자에 적용, 또는 다른 시스템에 위치 할 수 있습니다 바인딩 동질성은 ATP에 의해 조절됩니다. 화성 변조는 또한 단백질 상호 작용 사이의 동질성이 HSP90 시스템 (15)의 경우 radicicol 또는 geldanamycin 같은 특정 약물에 의해 변경 된 경우에 작동합니다. 우리 프로토콜의 명확한 제한이 필요하다는 것입니다 친화 - 정화 특정 치료 / 파트너 단백질위한 친화력을 변조 약물에 민감한 것으로 알려진 대상 단백질에 대한 항체를. 따라서 더 높은 처리량 방법이다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> ProteinA 세 파로스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (디메틸 pimelimidate) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D8388 </td><td> -20 ° C에서 말라 저장, 사용하기 전에 직접 분해 </td></tr><tr><td> (전체, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료) 프로테아제 억제제 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> 칼 로스 </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> 크레아틴 인산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 27,920 </td><td></td></tr><tr><td> 크리 phosphokinase </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [succinimidyl 프로 피오 네이트] </td><td> Sientific 열 </td><td> 22,585 </td><td> 4에 말라 저장 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 망할 CIA </td><td> 캠브리지 동위 원소 실험실, 앤도버, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> LYS-C (Endoproteinase LYS-C) </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 비즈 (Poroszyme는 트립신을 고정) </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> 직접 사용하기 전에 힘차게 믹스 </td></tr><tr><td> Empore C 18 47mm 디스크 </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

단백질 - 단백질 상호 작용은 세포의 많은 생물학적 과정에 대한 기본입니다. 따라서, 그들의 특성은 조사 1 확인할 수 있습니다 방법을 현재의 연구 및 과다에 중요한 역할을합니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 종종 매우 역동적이며, subcellular 지방화, 포스트 병진 수정과 지역 단백질 환경이에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 그들은 공동 immunoprecipitation 접근 방식이 선택 (3)의 방법입니다있는 그들의 자연 환경에서 조사해야합니다. 공동 시켰던 상호 작용 파트너는 타겟이 불분명 한 방식으로 타겟팅 된 접근, 또는 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 의해 immunoblotting 중 하나로 식별됩니다. 후자의 전략은 종종 부정적인 주로 자신 unspecifically precipitating 단백질의 흔적을 감지 현대적인 질량 분석기의 높은 감도에서 파생 된 잘못된 긍정적 인 발견의 많은에 의해 영향을받습니다. recen이 문제를 극복 할 수 t의 접근 방식은 아이디어에 기초 unspecifically precipitating 단백질의 양이 영향을받지 않습니다 동안 특정 상호 작용 파트너의 감소 금액은, 세포 농도 RNAi에 의해 감소​​ 주어진 대상 단백질과 공동 침전물 할 것입니다. 이 방법은, 최저 4 결합 양적 Immunoprecipitation에 대한 QUICK 칭했다 야생 유형과 노크 다운 긴장에서 immunoprecipitated 단백질의 양을 정량화하는 안정적인 동위 원소 전지 문화에 아미노산의 라벨링 (SILAC) 5 MS을 사용합니다. 1:1 비율에서 발견 된 단백질은 오염 물질, 대상 단백질의 특정 상호 작용 파트너로 야생 유형에서 침전물에 풍부한 사람들로 간주 될 수 있습니다. 혁신, QUICK 일부 제한이지지하지만 : 먼저, SILAC 비용이 많이 이상적 아르기닌 및 / 또는 리신에 대한 auxotrophic 아르 생물로 제한됩니다. addit에 또한, 무거운 아르기닌이 공급 될 때, 아르기닌 - 투 - 프롤린 interconversion 결과ional 질량이 펩타이드 각 프롤린에 대한 연속 근무 약간 정량화 더 지루하고 5,6 정확도가 떨어질 수 있습니다 빛 아르기닌과 무거운 dilutes. 둘째, QUICK는 항체 그들이 노크 다운 뮤턴트에서 추출의 대상 단백질과 포화가되지 않는 등 titrated되어 있어야합니다. 여기 15 N 신진 대사 라벨에 SILAC을 대체하여, 단백질 - 단백질 상호 작용의 연관성 변조에 대한 RNAi로 인한 똑 다운 대체하여 QUICK의 abovementioned 한계를 극복 수정 QUICK 프로토콜을 소개합니다. 우리는 단세포 녹색 alga의 Chlamydomonas이 모델 생물 및 대상 단백질 7 (그림 1)과 엽록체의 HSP70B의 보호자로 reinhardtii 사용하여이 프로토콜의 적용을 보여줍니다. HSP70s는 특정 공동 보호자 만 ADP 상태 8 기판과 상호 작용하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 특정을 확인하는 수단으로이 속성을 이용의 염기 교환 요소 CGE1 9 HSP70B의 상호 작용.

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A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

우리는 TRUE와 FALSE 단백질 단백질 상호 작용을 구별하기 이전에 도입 된 QUICK (최저과 결합하여 정량 Immunoprecipitation) 접근 방식의 변화를 제시한다. 우리 접근 방식은 기반으로합니다<sup&gt; 15N</sup&gt; 신진 대사 라벨, ATP, immunoprecipitation, 그리고 양적 질량 분광법의 존재 / 부재에 의한 단백질 단백질 상호 작용의 동질성의 변조.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

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