Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

Vi takker Olivier Vallon for antiserum mot CF1β. Dette arbeidet ble støttet av Max Planck Society og tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (systembiologi Initiative forsys, prosjekt GoFORSYS).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Vi har nylig lansert to forbedringer i QUICK tilnærming: en crosslinking trinn for å fange forbigående protein-protein interaksjoner (QUICK-X), og en kontroll nedbør å normalisere for ulike nedbør effektivitet 6. Her presenterer vi en protokoll som inneholder to flere forbedringer av Quick: for det første erstatter vi SILAC 5 for 15 N metabolsk merking. Fordelene er at 15 N metabolsk merking er mye billigere enn SILAC hvis 15 N er gitt som enkel uorganisk salt. Videre med 15 N metabolsk merking QUICK kan påføres organismene prototrofe for alle aminosyrer, som de fleste planter, sopp og bakterier. Og til slutt, ikke arginin-til-proline interkonversjon iboende til SILAC 5,6 ikke presentere et problem for kvantifisering av 15 N merket peptider. Eksempler på egnede verktøy for kvantitativ vurdering av 15 N proteomikk data er MSQUANT 12 eller jegOMIQS 13. Sekund, introduserer vi affinitet modulasjon som et middel for spesifikt å redusere mengden av proteiner i samspill med en gitt målprotein i en prøve og en annen. Fordelene med denne fremgangsmåten er at det omgår bygging av knockdown mutanter, som for noen modellsystemer er vanskelig å generere eller ikke kan genereres i det hele tatt i tilfelle av essensielle target proteiner. Videre unngår den feiltolkninger forårsaket av differensial protein ekspresjon potensielt oppstått som respons av cellen til banket ned et målprotein: hvis andre proteiner er nedregulert samt og kryssreagerer med antiserumet som brukes for immunoutfelling, ville de tolkes som sanne interaksjonspartnere av målet protein. Endelig, avskaffer affinitet modulasjon behovet for å finne en riktig antistoff til antigen ratio. Selv om vi bruker vår protokoll til Chlamydomonas reinhardtii som modell organisme, Kan den enkelt tilpasses enhver annen organisme som kan dyrkes i cellekultur og er i stand til å bruke ammonium-eller nitrat som nitrogenkilde. Affinity modulering av protein komplekser av ATP / ADP kan direkte brukes til andre anstand som interaksjon med underlag og kohortstudier proteiner avhenger ATP staten, som de GroEL/HSP60/Cpn60 eller HSP90 anstand systemer 14,15, eller til et annet system der bindingsaffiniteter er modulert av ATP. Affinity modulasjon bør også arbeide for tilfeller der slektskap mellom protein interaksjoner er endret av bestemte legemidler, som radicicol eller geldanamycin i tilfelle av HSP90 systemer 15. En klar begrensning av protokoll vår er at det krever affinitetsrenset antistoffer mot et målprotein kjent for å være følsomme for en spesifikk behandling / stoff som modulerer dets affinitet for partner proteiner. Derfor er det ingen høy-throughput metoden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimethyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Lagre desiccated ved -20 ° C, løses direkte før bruk </td></tr><tr><td> Proteasehemmer (komplett, EDTA-fri) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinfosfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinfosfokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP ditiobis [succinimidyl propionate] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22585 </td><td> Lagre desiccated ved 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH4Cl </td><td> Cambridge isotoplaboratorier, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin perler (Poroszyme Immobilisert Trypsin) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Bland kraftig rett før bruk </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Protein-protein interaksjoner er grunnleggende for mange biologiske prosesser i cellen. Derfor spiller deres karakterisering en viktig rolle i dagens forskning og en mengde metoder for deres undersøkelse er tilgjengelig 1. Protein-protein interaksjoner ofte er svært dynamisk og kan avhenge subcellulære lokalisering, post-translasjonelle modifikasjoner og det lokale proteinet miljøet 2. Derfor bør de undersøkes i sitt naturlige miljø, som co-immunoutfelling tilnærminger er metoden for valg 3. Co-utfelte interaksjonspartnere identifiseres enten ved immunoblotting på en målrettet tilnærming, eller ved massespektrometri (LC-MS/MS) i en vilkårlige måte. Den sistnevnte strategi ofte er ugunstig påvirket av et stort antall falske positive funn, hovedsakelig avledet fra den høye følsomheten til moderne massespektrometre som trygt oppdage spor av uspesifikt fellingskjemikalier proteiner. En recent tilnærming å overvinne dette problemet er basert på ideen om at reduserte mengder av spesifikke interaksjonspartnere vil co-presipitat med en gitt målprotein hvis cellulære konsentrasjonen reduseres med RNAi, mens mengder av uspesifikt fellingskjemikalier proteiner bør være upåvirket. Denne tilnærmingen, kalt QUICK for kvantitative Immunoutfellingsanalyse Kombinert med Knockdown 4, sysselsetter stabile isotoper Merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) 5 og MS å kvantifisere mengder proteiner immunoutfelt fra villtype og knock-down stammer. Proteiner som finnes i forholdet 1:1 kan betraktes som forurensninger, de anriket på presipitater fra villtype som bestemte interaksjonspartnere av målproteinet. Selv innovative, bærer QUICK noen begrensninger: For det første, er SILAC kostnadskrevende og begrenset til organismer som ideelt er auxotrop for arginin og / eller lysin. Videre, når bygg arginin mates, arginin-til-prolin interkonversjon resultater i additional massen turnus for hver prolin i et peptid og litt dilutes tung med lys arginin, som gjør kvantifisering mer langtekkelig og mindre nøyaktige 5,6. Sekund, krever rask at antistoffer titreres slik at de ikke blir mettet med mål protein i ekstrakter fra knock-down mutanter. Her introduserer vi en modifisert QUICK protokoll som overvinner de ovennevnte begrensningene QUICK ved å erstatte SILAC for 15 N metabolsk merking og ved å erstatte RNAi-mediert banke ned for affinitet modulering av protein-protein interaksjoner. Vi viser anvendelsen av denne protokollen ved hjelp av den encellede grønnalgen Chlamydomonas reinhardtii som modell organisme og kloroplast HSP70B anstand som målprotein 7 (figur 1). HSP70s er kjent for å samhandle med bestemte co-anstand og underlag bare i ADP staten 8. Vi utnytte denne egenskapen som et middel for å kontrollere den spesifikkeinteraksjon HSP70B med sin nukleotid utveksling faktor CGE1 9.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Vi presenterer en variant av den QUICK (kvantitativt Immunoutfelling Kombinert med Knockdown) tilnærming som ble introdusert tidligere å skille mellom sanne og falske protein-protein interaksjoner. Vår tilnærming er basert på<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolsk merking, modulering av affiniteter av protein-protein interaksjoner ved tilstedeværelse / fravær av ATP, immunoutfelling og kvantitativ massespektrometri.

En protokoll for identifikasjon av protein-protein interaksjoner Basert på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolsk Merking, Immunoutfellingsanalyse, Quantitative massespektrometri og Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifisering av protein komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Med sekvensiell Peptide affinitetsrensing i kombinasjon med tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

En ny tilnærming til den komparative analysen av Multiprotein Komplekser Basert på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolsk Merking og kvantitativ massespektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunutfelling analyse for identifikasjon av Arabidopsis Protein-DNA interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identifisering av myod interactome Bruke Tandem Affinity Rensing Koblet til massespektrometri

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studiet av Protein-protein interaksjoner i Autophagy forskning

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifisering av områdespesifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometri ved hjelp av Data-uavhengig oppkjøpet massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...