Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

Мы благодарим Оливье Vallon для антисыворотки против CF1β. Эта работа была поддержана Общества Макса Планка и гранты от Deutsche Forschungsgemeinschaft (Шредингера 617/5-1) и Bundesministerium für Bildung унд Forschung (Systems Biology инициатива Forsys, проект GoFORSYS).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы недавно представил два усовершенствования быстрый подход: сшивание шаг для захвата переходных белок-белковых взаимодействий (QUICK-X), и контроль осадков нормализовать для неравных эффективность осадков 6. Здесь мы приводим протокол, содержащий два более быстрых улучшений: во-первых, заменить SILAC 5 по 15 N метаболических маркировки. Преимущество в том, что 15 N метаболических маркировки гораздо дешевле, чем SILAC, если 15 N предоставляется как простые неорганические соли. Кроме того, с 15 N метаболических маркировки Быстрый могут быть применены к прототрофный организмов для всех аминокислот, как и большинство растений, грибов и бактерий. И, наконец, аргинин-на-пролина взаимопревращения присущие SILAC 5,6 не представляет проблемы для количественной оценки 15 N меченых пептидов. Примеры подходящих инструментов для количественной оценки 15 N протеомики данных MSQUANT 12 или яOMIQS 13. Во-вторых, введем близость модуляции в качестве средства специально для уменьшения количества белков, взаимодействующих с данным белком-мишенью в одном образце по сравнению с другой. Преимущества этого подхода в том, что она обходит строительства нокдаун мутантов, которые для некоторых моделей системы трудно генерировать или не могут быть созданы на всех в случае существенного белков-мишеней. Кроме того, это позволяет избежать неправильного толкования вызвана дифференциальной экспрессии белка потенциально возникающих как ответ клетки на стук вниз белка-мишени: если другие белки вниз регулируется также и перекрестную реакцию с сывороткой для иммунопреципитации, они будут интерпретированы в качестве полноправных партнеров взаимодействия белка-мишени. Наконец, близость модуляции отменяет необходимость нахождения надлежащего антитела к антигену отношение. Хотя мы применяем наши протокол к Chlamydomonas reinhardtii в качестве модельного организма, Она может быть легко адаптирована к любой другой организм, который можно выращивать в культуре клеток и может использовать нитрат аммония или в качестве источника азота. Affinity модуляции белковых комплексов АТФ / АДФ могут быть непосредственно применены к другим сопровождающим, взаимодействие с субстратами и когорты белков зависит от состояния СПС, как GroEL/HSP60/Cpn60 или HSP90 шаперона системы 14,15, или на любой другой системе, где сродства модулируются СПС. Affinity модуляции также должны работать для случаев, когда сходство между белковых взаимодействий изменены определенные лекарственные препараты, как radicicol или гелданамицина в случае HSP90 системы 15. Четкое ограничение нашего протокола является то, что она требует аффинно очищенные антитела к белку-мишени, как известно, чувствительны к специфического лечения / препарат, который модулирует его сродство к партнеру белков. Таким образом, это не высокая пропускная способность метода.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> ProteinA сефарозой </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (диметил pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Хранить высушенный при температуре -20 ° C, растворяют непосредственно перед употреблением </td></tr><tr><td> Ингибитор протеазы (полный, EDTA-бесплатно) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> АТФ (аденозина-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Креатин фосфат </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Креатинфосфокиназы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP дитиобис [сукцинимидил пропионат] </td><td> Thermo станет научным </td><td> 22585 </td><td> Хранить высушенный при температуре 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge изотопных лабораторий, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (эндопротеиназы Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Трипсин бисера (Poroszyme иммобилизованного трипсина) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Смешать энергично непосредственно перед использованием </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 мм дисками </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Мы представляем изменения БЫСТРО (количественные Иммунопреципитация в сочетании с Нокдаун) подход, который был введен ранее различать истинные и ложные белок-белковых взаимодействий. Наш подход основан на<sup&gt; 15N</sup&gt; Метаболических маркировки, модуляция сродства белок-белковых взаимодействий по наличию / отсутствию АТФ, иммунопреципитации и количественного масс-спектрометрии.

Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический Маркировка и количественный Масс-спектрометрия

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em&gt; В Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Исследование взаимодействий протеин протеина в Autophagy исследований

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...