Name: a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

Vi tackar Olivier Vallon för antiserum mot CF1β. Detta arbete stöddes av Max Planck-sällskapet och bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (systembiologi Initiative FORSYS, projektledare GoFORSYS).

<ol>
	<li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+macromolecular+complex:+the+toolkit+of+methods.">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li><li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-immunoprecipitations+revisited:+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins.">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+(QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+(SILAC).">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li><li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C.">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li><li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox.">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones:+cellular+functions+and+molecular+mechanism.">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li><li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas:+two+isoforms+generated+by+differential+splicing.">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li><li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSQuant,+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics.">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li><li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines.">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li><li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hsp90+chaperone+machinery.">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Vi har nyligen infört två förbättringar QUICK tillvägagångssättet: en tvärbindande steg för att fånga övergående protein-protein interaktioner (QUICK-X) och en kontroll fällning att normalisera för ojämlika nederbörd effektivitetsvinster 6. Här presenterar vi ett protokoll som innehåller två fler förbättringar av Quick: för det första ersätter vi SILAC 5 för 15 N metabolisk märkning. Fördelarna är att 15 N metabolisk märkning är mycket billigare än SILAC, om 15 N tillhandahålles som enkel oorganiskt salt. Vidare, med 15 N metabolisk märkning SNABB kan tillämpas på organismer prototrofa för alla aminosyror, som de flesta växter, svampar och bakterier. Och slutligen, inte medför arginin till prolin omvandling inneboende SILAC 5,6 inte ett problem för kvantifiering av 15 N märkta peptider. Exempel på lämpliga verktyg för kvantitativ utvärdering av 15 N proteomik data MSQUANT 12 eller jagOMIQS 13. Det andra introducerar vi affini modulering som ett medel för att specifikt reducera mängden av proteiner som interagerar med ett givet målprotein i ett prov mot en annan. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är att det kringgår konstruktionen av knockdown mutanter, som för vissa modellsystem är svåra att generera eller inte kan genereras alls vid väsentliga målproteiner. Dessutom undviker man feltolkningar orsakade av differentiell proteinexpression potentiellt förekommer som ett svar av cellen till knackning-ner ett målprotein: om andra proteiner är nedreglerade samt och korsreagerar med antiserumet som används för immunoutfällning, skulle de tolkas som sanna interaktionspartner av målproteinet. Äntligen avskaffas affinitet modulering behovet av att hitta en lämplig antikropp till antigen förhållande. Även om vi tillämpar vår protokoll till Chlamydomonas reinhardtii som modellorganism, Kan den lätt anpassas till någon annan organism som kan odlas i cellkultur och kan använda ammonium-eller nitrat som kvävekälla. Affinity modulering av proteinkomplex med ATP / ADP kan direkt tillämpas på andra kaperoner vars interaktion med substrat och proteiner kohort beror på ATP tillståndet, liksom de GroEL/HSP60/Cpn60 eller HSP90 eskortering system 14,15, eller till något annat system där bindningsaffiniteter moduleras av ATP. Affinity modulering bör också arbeta för fall där tillhörighet bland proteininteraktioner ändras genom specifika läkemedel, som radicicol eller geldanamycin i fallet med Hsp90 system 15. En tydlig begränsning av vår protokollet är att den kräver affinitetsrenade antikroppar mot ett målprotein känd för att vara känslig för en särskild behandling / läkemedel som modulerar dess affinitet för partner proteiner. Därför är det ingen hög genomströmning metod.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Förvara uttorkad vid -20 ° C, lös direkt före användning </td></tr><tr><td> Proteasinhibitor (fullständig, EDTA-fri) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinfosfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27.920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatinfosfokinas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP ditiobis [succinimidylpropionat] </td><td> Thermo Sientific </td><td> 22.585 </td><td> Förvara torkmedel vid 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isotop laboratorier, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinas Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin pärlor (Poroszyme Immobilized Trypsin) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Blanda kraftigt direkt före användning </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for the identification of protein-protein interactions based on 15n metabolic labeling, immunoprecipitation, quantitative mass spectrometry and affinity modulation

Protein-proteininteraktioner är grundläggande för många biologiska processer i cellen. Därför spelar deras karakterisering en viktig roll i aktuell forskning och en uppsjö av metoder för sin undersökning finns 1. Protein-proteininteraktioner är ofta mycket dynamiska och kan bero på subcellulär lokalisering, post-translationella modifieringar och den lokala proteinet miljön 2. Därför bör de undersökas i sin naturliga miljö, där samtidig immunoprecipitation metoder är den metod som föredras 3. Samutfälld interaktion partners identifieras antingen genom immunoblotting i en målinriktad strategi, eller med masspektrometri (LC-MS/MS) i en oriktade sätt. Den senare strategin ofta påverkas negativt av ett stort antal falska positiva upptäckter, härrör huvudsakligen från den höga känsligheten hos moderna masspektrometrar som tryggt upptäcka spår av ospecifikt utfällande proteiner. En recent strategi för att övervinna detta problem är baserad på tanken att reducerade mängder av specifika interaktionspartner kommer samfällning med ett givet målprotein vars cellulär koncentration reduceras med RNAi, medan mängderna av ospecifikt utfällande proteiner bör vara opåverkad. Detta tillvägagångssätt, som kallas QUICK för kvantitativ Immunoprecipitation kombination med Knockdown 4, använder stabila isotopen Märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) 5 och MS att kvantifiera mängden protein immunfälldes från vildtyp och knock-down stammar. Proteiner som finns i ett förhållande av 1:1 kan betraktas som föroreningar, de anrikas i fällningar från vildtypen som specifika interaktion partner målproteinet. Även innovativa bär QUICK vissa begränsningar: för det första, är SILAC kostsamma och begränsade till organismer som helst är auxotrofa för arginin och / eller lysin. Dessutom, när tunga arginin matas, arginin-till-prolin interomvandling leder additional massa skiftar för varje prolin i en peptid och något späder tung med ljus arginin, vilket gör kvantifiering mer tråkiga och mindre exakt 5,6. Det andra, kräver snabb att antikroppar titreras så att de inte blir mättad med målprotein i extrakt från knock-down mutanter. Här presenterar vi ett modifierat QUICK protokoll som övervinner de ovan nämnda begränsningarna i Quick genom att ersätta SILAC för 15 N metabolisk märkning och genom att ersätta RNAi-medierad knock-down för affinitet modulering av protein-protein interaktioner. Vi visar tillämpningen av detta protokoll att använda encelliga grönalger Chlamydomonas reinhardtii som modell organism och kloroplasten HSP70B förkläde som målprotein 7 (Figur 1). HSP70s är kända för att interagera med specifika co-chaperoner och substrat endast i ADP staten 8. Vi utnyttjar den här egenskapen som ett sätt att kontrollera de särskildainteraktion HSP70B med dess nukleotid utbyte faktor CGE1 9.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Aff

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Vi presenterar en variation av QUICK (Quantitative Immunoprecipitation kombination med Knockdown) strategi som infördes tidigare att skilja mellan sanna och falska protein-protein interaktioner. Vår strategi bygger på<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolisk märkning, modulering av affiniteter av protein-protein-interaktioner genom närvaron / frånvaron av ATP, immunprecipitation och kvantitativ masspektrometri.

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En kvantitativ bedömning av jästen Lipidome med elektrospray Spektrometri jonisation

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

En ny metod för jämförande analys av multiproteinkomplex baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolic Märkning och kvantitativ masspektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identifiering av MyoD Interactome Använda Tandem Affinity Purification Kopplad till masspektrometri

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studie av Protein-protein interaktioner i autofagi forskning

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifiering av platsspecifika Protein lysin acetylering och Succinylation stökiometri använder Data-oberoende förvärv masspektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...