Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Luminex Corporation.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Dette arbejde blev udført på Luminex Corporation med udstyr fremstillet på Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore er strategiske partnere for Luminex Corporation, licens til at udvikle og kommercialisere multiplex xMAP-baserede analyser.

Omdannelse af en ELISA-assay til Luminex xMAP platformen kan være så simpelt som at substituere streptavidin-peberrodsperoxidase (SA-HRP) i en typisk ELISA kit med streptavidin phycoerythrin (SA-PE), og optimering af ydeevne. For dem, der ønsker at oprette en xMAP immunoassay fra jorden op, kan dette ske med en simpel protokol, som også gør det muligt hurtigt, multiplex evaluering af antistof par. Reagenserne til xMAP assayet blev let fremstillet ved anvendelse af xMAP antistof Coupling Kit&#39;et at koble de udpegede indfangnings-antistoffer til MagPlex lav koncentration mikrosfærer. Anvendelsen af ​​en lav koncentration mikrokugler reducerer omkostningerne til assayet udvikling samtidig med det samme assay ydeevne højere koncentration mikrosfærer. Den mængde tid, der kræves til fremstilling koblet MagPlex mikrosfærer er cirka 3 timer, hvilket er meget hurtigere end 22 - 24 timer for at belægge brønd i en ELISA-plade, efterfulgt af behandlingDe coatede brønde. Udførelse af xMAP assayet er også overlegen i forhold til ELISA med hensyn til detektionsgrænse (&lt;4 pg / ml versus&gt; 31 pg / ml) og dynamikområde (&lt;4 pg / ml til&gt; 8000 pg / ml versus 16 pg / ml til 1000 pg / ml). Plade læsere har en begrænset OD område, som er enten 3 eller 4 OD, begrænser den øvre grænse for det dynamiske område for en assay. Utvivlsomt vil ikke alle antistoffer virker i et ELISA-format, og ikke alle antistoffer, der fungerer godt i en ELISA er let overføres til xMAP assayformat. Men eftersom xMAP assays kan multiplekses (dvs. køres samtidigt), er det muligt at evaluere flere indfangning og påvisning antistof kombinationer samtidigt at identificere den bedste par til brug for et assay. Denne fremgangsmåde sparer betydelig tid og reagenser i forhold til ELISA udvikling procedure, der er begrænset til evaluering af et par ad gangen. Hvis to eller flere antistoffragmenter par udføre tilsvarende; andre parametre af assayet kananses for at bestemme egnethed af parret (f.eks tilgængelighed, pris, etc.). Ud over forbedret assay ydeevne og fleksibilitet med xMAP assay, er der også signifikante omkostningsbesparelser. Den anbefalede mængde af antistof, der kræves til at belægge en enkelt brønd på en ELISA-plade er 400 ng, medens den mængde, der kræves for perlerne anvendes i en brønd i en xMAP assay er ca 7,5 ng. Således er mængden af ​​antistof påkrævet til en ELISA og giver mere end 50 testresultater, hvis de anvendes i en xMAP assay. Til anvendelser, der involverer kostbare prøver også xMAP har en betydelig fordel. Volumenet af prøven anbefales til ELISA er 100 uL hvorimod volumen, der kræves for xMAP assayet kan være halvdelen af ​​den, eller mindre. Sammenfattende, er omdannelsen af ​​en ELISA-analyse for at Luminex xMAP platform ukompliceret, effektiv og omkostningsbesparende, og samtidig producere en analyse med overlegen dynamikområde og følsomhed.

<table border="1"><tbody><tr><td> Beskrivelse </td><td> Vendor </td><td> Katalognr </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA-kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Indbefatter monoklonale og biotin koblet polyklonale antistoffer og rekombinant TNF-α-proteinet standard </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistof mod TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Indfangningsantistof, klon CH8820 </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistof mod TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin koblet Detection antistof, klon AS1 </td></tr><tr><td> TNF-alfa-protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinant TNF-α-proteinet standard </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistof mod TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50.115 </td><td> Indfangningsantistof, klon 4H31 </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistof mod TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78.162 </td><td> Biotin koblet Detection antistof, klon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF-alfa-protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18.460 </td><td> Rekombinant TNF-α-proteinet standard </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistof mod TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Indfangningsantistof, klone 3C7.2 </td></tr><tr><td> Polyklonalt antistof mod TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Polyklonalt kanin detektionsantistof </td></tr><tr><td> Streptavidin-phycoerythrin </td><td> Moss </td><td> SAPE-001 </td><td> Fluorescerende reporter reagens til Luminex xMAP Assay </td></tr><tr><td> MAGPIX w / xPONENT Software </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Luminex Instrument </td></tr><tr><td> xMAP Antistof Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Omfatter EDC reagens, Sulfo-NHS-reagens, aktivering puffer, vaskepuffer, 1,5 ml reaktionsrørene, og engangsartikler pipetter </td></tr><tr><td> MagPlex Mikrosfærer, lav koncentration </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Lave koncentrationer perler (@ 2,5 x 10 6 perle / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21.335 </td><td> Biotinyleringskit for umodificeret detektionsantistof </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> ELISA-pladelæser </td></tr><tr><td> Phosphatbufret saltvand </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assaybuffer </td></tr><tr><td> One-Pint Kompakt ultralydsrenser, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> Fremstil en effektiv drift frekvens på 55 kHz </td></tr><tr><td> Magnetisk rørsseparatoren </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> Til enkelt 1,5 ml rør magnetisk separation i koblingselementerne vasketrin </td></tr><tr><td> Magnetiske plade Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Til 96-brønds plade magnetisk adskillelse assay vasketrin </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Den enzym-linket immunosorbent assay (ELISA) har længe været det primære middel til påvisning af analytter af interesse i biologiske prøver for både life science forskning og klinisk diagnostik. Imidlertid ELISA har sine begrænsninger. Det er typisk udført i en 96-brønds mikroplade, og brøndene coatet med indfangningsantistof, som kræver en forholdsvis stor mængde prøve til at indfange et antigen af ​​interesse. Det store overfladeareal af brøndene, og den hydrofobe bindingen af ​​indfangende antistof kan også føre til ikke-specifik binding og øget baggrund. Desuden har de fleste ELISA&#39;er afhængige af enzym-medierede amplifikation af signal for at opnå en rimelig følsomhed. Sådan amplifikation er ikke altid lineære og kan således forvrænge resultater. I de seneste 15 år har en ny teknologi frem, der giver fordelene ved ELISA, men muliggør også højere overførselshastighed, øget fleksibilitet, reduceret prøvevolumen, og lavere omkostninger, med en lignende workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology er en mikrosfære (perle) række platform, så både monoplex og multiplex assays, der kan anvendes til både protein og nukleinsyre applikationer 3-5. Perlerne har det indfangende antistof kovalent immobiliseret på et mindre overfladeareal, som kræver mindre indfangningsantistof og mindre prøvevolumener, sammenlignet med ELISA, og ikke-specifik binding reduceres betydeligt. Mindre prøvevolumener er vigtige, når der arbejdes med begrænsende prøver, såsom cerebrospinalvæske, synovialvæske, etc. 6. Multipleksering assayet reducerer yderligere prøvevolumen krav, hvorved flere resultater fra en enkelt prøve. Nylige forbedringer ved Luminex omfatter: det nye MAGPIX system en mindre, billigere, nemmere at anvende analysator; lav koncentration Magnetic MagPlex mikrokugler, som eliminerer behovet for dyre filterplader og kommer i en arbejdskoncentration bedre egnet til assay udvikling oglav-throughput anvendelser og xMAP antistof Coupling (ABC) kit, som omfatter en protokol, reagenser og hjælpematerialer, der er nødvendige til kobling perler til indfangningsantistoffet af interesse. (Se Materialer afsnittet for en detaljeret liste over kit indhold.) I dette eksperiment, konvertere vi en præ-optimeret ELISA-assay for TNF-alfa cytokin til xMAP platformen og sammenligne effektiviteten af de to metoder 7-11. TNF-alfa er en biomarkør anvendt til måling af inflammatoriske responser i patienter med autoimmune sygdomme. Vi begynder med at koble fire kandidatlande indfangningsantistoffer til fire forskellige mikrosfæreformuleringerne sæt eller regioner. Når de blandes sammen, de fire sæt mulighed for samtidig test af alle fire kandidater med fire separate påvisnings-antistoffer for at bestemme den bedste antistof par, sparer reagenser, prøve og tid. To xMAP analyser derefter konstrueret med de to mest optimale antistof par og deres præstationer ersammenlignet med det oprindelige ELISA-assay med hensyn til signalstyrke, dynamikområde, og følsomhed.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

En ELISA let kan omdannes til en Luminex xMAP assay og gennem fordelene ved multipleksing flere antistoffer kan screenes samtidigt at identificere en optimal antistof par, hvilket resulterer i forøget følsomhed og dynamikområde, og samtidig reducere assay omkostninger.

Omdannelse af en ELISA til en Luminex xMAP assay under anvendelse af en multiplex antistof screeningsmetode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerende screeningsassay til identifikation af modulatorer af GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler til at studere protein-protein interaktion: poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Funktionel Screening ved hjælp af en hjemmelavet Dual-glød Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-nukleare Antibody Screening Brug HEp-2-celler

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metode til at vælge Struktur-skifte Aptamerer Anvendt på en kolorimetrisk Gold Nanopartikel Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifikation af kinase-substrat Pairs Brug højkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...