Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door Luminex Corporation.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Dit werk werd gedaan op Luminex Corporation met materiaal dat is vervaardigd op Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore zijn strategische partners van Luminex Corporation, een vergunning voor het ontwikkelen en commercialiseren multiplex xMAP gebaseerde testen.

De omzetting van een ELISA-test op de Luminex xMAP platform kan zo simpel zijn als vervanging van streptavidine mierikswortelperoxidase (SA-HRP) in een typisch ELISA kit met streptavidine phycoerythrin (SA-PE), en het optimaliseren van prestaties. Voor degenen die willen een xMAP immunoassay te maken van de grond af, kan dit worden bereikt met een eenvoudig protocol dat maakt het ook mogelijk de snelle, multiplex evaluatie van het antilichaam paren. De reagentia voor de xMAP assay werden gemakkelijk bereid met xMAP antilichaam koppeling kit te koppelen aangewezen opname antilichamen MagPlex lage concentratie microsferen. Het gebruik van lage concentratie microsferen vermindert de kosten van assay ontwikkeling en biedt dezelfde test de prestaties van hogere concentratie microsferen. De hoeveelheid tijd die nodig is om gekoppeld MagPlex microsferen voor te bereiden is ongeveer 3 uur, dat is veel sneller dan de 22 - 24 uur nodig is om de vacht van de put van een ELISA-plaat, gevolgd door een behandelingvan het gecoate putjes. De prestaties van de xMAP assay ook boven de ELISA qua detectielimiet (&lt;4 pg / ml tegen&gt; 31 pg / ml) en het dynamisch bereik (&lt;4 pg / ml tot&gt; 8000 pg / ml tegen 16 pg / ml tot 1,000 g / ml). Plaat lezers hebben een beperkt bereik OD die ofwel is 3 of 4 OD, het beperken van de bovengrens van het dynamisch bereik voor een test. Ongetwijfeld zullen niet alle antistoffen werken in een ELISA-formaat en niet alle antistoffen die goed werken in een ELISA zijn gemakkelijk overdraagbaar naar de xMAP test-formaat. Aangezien xMAP assays worden gemultiplext (dwz uitgevoerd gelijktijdig), is het mogelijk om meerdere vangen en detectie-antilichaam combinaties gelijktijdig evalueren de beste paar vast te gebruiken voor een bepalingsmethode. Dit proces bespaart veel tijd en reagentia ten opzichte van de ELISA ontwikkeling procedure, die de evaluatie van een paar beperkt tegelijk. Indien twee of meer paren antilichaam voeren equivalent, andere parameters van de test kangeacht geschikt het paar (bijvoorbeeld beschikbaarheid, prijs, enz.) te bepalen. Naast de verbeterde uitvoering van de assay en flexibiliteit met de xMAP test, zijn er ook aanzienlijke kostenbesparingen. De aanbevolen hoeveelheid antistoffen die nodig voor het coaten van een goed van een ELISA-plaat is 400ng, dat de hoeveelheid die nodig is voor de kralen gebruikt in een put van een xMAP test is ongeveer 7,5 ng. Aldus is de hoeveelheid antilichaam dat voor een ELISA en zal meer dan 50 testresultaten, indien gebruikt in een xMAP assay. Voor toepassingen waarbij kostbare stalen, xMAP heeft ook een belangrijk voordeel. De hoeveelheid monster aanbevolen voor de ELISA 100 pi dat het volume vereist voor de xMAP assay kan helft van dat of minder. In het kort, conversie van een ELISA-test op de Luminex xMAP platform is eenvoudig, efficiënt en kostenbesparend, terwijl het produceren van een test met een superieure dynamisch bereik en gevoeligheid.

<table border="1"><tbody><tr><td> Beschrijving </td><td> Verkoper </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Inclusief monoklonale en biotine gekoppeld polyklonale antilichamen en recombinante TNF-α eiwit standaard </td></tr><tr><td> Monoclonaal antilichaam tegen TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Capture antilichaam, kloon CH8820 </td></tr><tr><td> Monoclonaal antilichaam tegen TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotine gekoppelde detectieantilichaam, kloon AS1 </td></tr><tr><td> TNF alfa eiwit </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Recombinant TNF-α eiwit standaard </td></tr><tr><td> Monoclonaal antilichaam tegen TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Capture antilichaam, kloon 4H31 </td></tr><tr><td> Monoclonaal antilichaam tegen TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotine gekoppelde detectieantilichaam, kloon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alfa eiwit </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Recombinant TNF-α eiwit standaard </td></tr><tr><td> Monoclonaal antilichaam tegen TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Capture antilichaam, klonen 3C7.2 </td></tr><tr><td> Polyklonaal antilichaam aan TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Konijn polyklonale detectieantilichaam </td></tr><tr><td> Streptavidine-fycoerythrine </td><td> Mos </td><td> SAPE-001 </td><td> TL-verslaggever reagens voor Luminex xMAP Assay </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Xponent Software </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-Xponent </td><td> Luminex Instrument </td></tr><tr><td> xMAP antilichaam Koppeling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Inclusief EDC reagens, sulfo-NHS reagens, activering buffer, wasbuffer, 1,5 ml reageerbuisjes, en wegwerp pipetten </td></tr><tr><td> MagPlex Microspheres, lage concentratie </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Lage concentratie kralen (@ 2,5 x 10 6 kraal / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinylering kit voor detectie-antilichaam ongewijzigde </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> Elisa-afleesapparaat </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assay Buffer </td></tr><tr><td> One-Pint Compact Ultrasone Reiniger, 115 VAC </td><td> Cole Parmer- </td><td> WU-08849-00 </td><td> Maak een effectieve frequentie van 55 kHz </td></tr><tr><td> Magnetische Tube Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288 tot 01 </td><td> Voor alleenstaanden 1,5 ml buis magnetische scheiding in koppeling wasstappen </td></tr><tr><td> Magnetische Plaat Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Voor de 96-wells plaat magnetische scheiding in test wasstappen </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Het enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) is al lange tijd het belangrijkste instrument voor de detectie van analyten in biologische monsters voor zowel de life science onderzoek en klinische diagnostiek. Echter, ELISA heeft beperkingen. Het wordt doorgaans uitgevoerd in een 96-wells microplate en de putjes bekleed met capture antilichaam, waarbij een relatief grote hoeveelheid monster naar een antigeen van interesse hebben. Het grote oppervlak van de putten en de hydrofobe binding van capture antilichaam kan ook leiden tot niet-specifieke binding en meer achtergrond. Bovendien meeste ELISA vertrouwen op enzym-bemiddelde amplificatie van het signaal om redelijke gevoeligheid. Een dergelijke versterking is niet altijd lineair en kan dus scheef resultaten. In de afgelopen 15 jaar, heeft een nieuwe technologie bleek dat biedt de voordelen van de ELISA, maar maakt ook een hogere doorvoersnelheid, meer flexibiliteit, minder monstervolume, en lagere kosten, met een vergelijkbare workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is een microsfeer (kraal) array-platform maakt het voor zowel monoplex en multiplex assays die kunnen worden toegepast op zowel eiwit en nucleïnezuur toepassingen 3-5. De korrels hebben capture antilichaam covalent geïmmobiliseerd op een kleiner oppervlak, waardoor minder capture antilichaam en kleiner monstervolumes, vergeleken met ELISA en niet-specifieke binding aanzienlijk wordt verminderd. Kleinere steekproef volumes zijn belangrijk bij het ​​werken met het beperken van monsters, zoals de cerebrospinale vloeistof, synoviale vloeistof, enz. 6. Multiplexen de assay reduceert monstervolume eisen, waardoor diverse resultaten van een enkel monster. Recente verbeteringen door Luminex zijn onder andere: het nieuwe MAGPIX systeem, een kleinere, minder dure, gemakkelijker te gebruiken analyzer, een lage concentratie Magnetic MagPlex microsferen die de noodzaak voor dure filter platen weg te nemen en komen in een werkende concentratie beter geschikt voor assay ontwikkeling enlage-throughput toepassingen, en de xMAP antilichaam Coupling (ABC) Kit, die een protocol, reagentia en verbruiksartikelen noodzakelijk voor het koppelen van kralen om de vangst antilichaam van belang omvat. (Zie Materialen sectie voor een gedetailleerde lijst van kit inhoud.) In dit experiment zetten we een vooraf geoptimaliseerde ELISA-test voor TNF-alfa cytokine de xMAP platform en vergelijk de prestaties van de twee methoden 7-11. TNF-alpha een biomarker gebruikt bij het bepalen van ontstekingsreacties bij patiënten met auto-immuunziekten. We beginnen door het koppelen van vier kandidaat-capture antilichamen tegen vier verschillende microsfeer sets of regio&#39;s. Bij het door elkaar, deze vier sets zorgen voor de gelijktijdige testen van alle vier de kandidaten met vier afzonderlijke detectie antistoffen tegen de beste antilichaam paar, het opslaan van reagentia, monster en tijd te bepalen. Twee xMAP assays worden dan uitgevoerd met de twee meest optimale antilichamen paren en hun prestatiesten opzichte van de oorspronkelijke ELISA assay met betrekking tot sterkte, dynamisch bereik en gevoeligheid.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Een ELISA kan gemakkelijk worden omgezet Luminex xMAP assay en door de voordelen van multiplexing verschillende antilichamen tegelijkertijd worden gescreend voor een optimale antilichaam paar identificeren resulteert in een verhoogde gevoeligheid en dynamisch bereik, met minder kosten assay.

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cel Capture Met behulp van een apparaat Microfluïdische

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-nucleaire antilichaam screening met HEp-2 cellen

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...