Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Ce travail a été financé par Luminex Corporation.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Ce travail a été fait à Luminex Corporation avec du matériel fabriqué à Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore sont des partenaires stratégiques de Luminex Corporation; licence pour développer et commercialiser des tests multiplex xMAP base.

La conversion d&#39;un test ELISA pour la plate-forme Luminex xMAP peuvent être aussi simples que la substitution streptavidine peroxydase de raifort (SA-HRP) dans un cadre typique kit ELISA avec de la streptavidine phycoérythrine (SA-PE), et l&#39;optimisation de la performance. Pour ceux qui veulent créer un immunoessai xMAP de la terre vers le haut, ce qui peut être accompli avec un protocole simple qui permet également l&#39;évaluation multiplex rapide, des paires d&#39;anticorps. Les réactifs pour le dosage xMAP ont été facilement préparés en utilisant le kit Anticorps xMAP couplage pour coupler les anticorps de capture désignés pour MagPlex faible concentration des microsphères. L&#39;utilisation d&#39;une faible concentration microsphères réduit le coût de l&#39;élaboration de tests, tout en offrant la performance de dosage même de concentration plus élevée des microsphères. Le montant de temps requis pour préparer couplé MagPlex microsphères est d&#39;environ 3 heures, ce qui est beaucoup plus rapide que les 22 - 24 heures nécessaires pour recouvrir le puits d&#39;une plaque ELISA, suivie d&#39;un traitementdes puits revêtus. La performance du test xMAP est également supérieure à la technique ELISA en termes de limite de détection (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / mL) et dynamique large (&lt;4 pg / mL à&gt; 8000 pg / ml contre 16 pg / ml à 1000 pg / mL). Lecteurs de plaques ont une gamme limitée DO qui est soit 3 ou 4 DO, limitant la limite supérieure de la plage dynamique pour un dosage. Sans doute, tous les anticorps travailler dans un format ELISA et tous les anticorps qui fonctionnent bien dans un test ELISA sont facilement transférables au format de dosage xMAP. Toutefois, étant donné que des dosages xMAP peuvent être multiplexés (c&#39;est à dire, fonctionner simultanément), il est possible d&#39;évaluer la capture de plusieurs combinaisons et détection des anticorps en même temps d&#39;identifier la meilleure paire à utiliser pour un essai. Ce processus permet d&#39;économiser beaucoup de temps et réactifs par rapport à la procédure d&#39;élaboration ELISA, qui se limite à l&#39;évaluation d&#39;une paire à la fois. Si deux ou plusieurs paires d&#39;anticorps effectuer équivalente; d&#39;autres paramètres de l&#39;essai peutêtre considéré pour déterminer l&#39;aptitude de la paire (par exemple, disponibilité, coût, etc.) En plus de la performance du test et une flexibilité améliorées avec le dosage xMAP, il ya aussi d&#39;importantes économies. La quantité recommandée d&#39;anticorps nécessaire pour enrober un seul puits d&#39;une plaque ELISA est 400ng, alors que la quantité requise pour les billes utilisées dans un puits d&#39;un dosage xMAP est d&#39;environ 7,5 ng. Ainsi, la quantité d&#39;anticorps nécessaire pour un ELISA ainsi fournira plus de 50 résultats des tests, si elle est utilisée dans un test xMAP. Pour les applications impliquant des échantillons précieux, xMAP a également un avantage significatif. Le volume de l&#39;échantillon recommandé pour le test ELISA est de 100 pi tandis que le volume requis pour le dosage xMAP peuvent être la moitié de ce que, ou moins. En résumé, la conversion d&#39;un test ELISA pour la plate-forme Luminex xMAP est simple, efficace et économique, tout en produisant un essai avec une gamme dynamique supérieure et de la sensibilité.

<table border="1"><tbody><tr><td> Description </td><td> Vendeur </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Comprend monoclonaux et de la biotine couplés des anticorps polyclonaux et recombinant standards protéine TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Anticorps de capture, clone CH8820 </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Anticorps Biotine détection couplé, clone AS1 </td></tr><tr><td> TNF alpha protéines </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Recombinant norme protéine TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Anticorps de capture, clone 4H31 </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Anticorps Biotine détection couplé, clone MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alpha protéines </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Recombinant norme protéine TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorps monoclonal anti-TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Anticorps de capture, cloner 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticorps polyclonaux anti-TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Anticorps polyclonal de lapin de détection </td></tr><tr><td> Streptavidine-phycoérythrine </td><td> Mousse </td><td> SAPE-001 </td><td> Réactif fluorescent pour reporter test Luminex xMAP </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software XPONENT </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Instrument Luminex </td></tr><tr><td> xMAP Anticorps Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Comprend réactif EDC, sulfo-NHS réactif, tampon d&#39;activation, tampon de lavage, des tubes de 1,5 mL de réaction, et les pipettes jetables </td></tr><tr><td> MagPlex microsphères, à faible concentration </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Perles à faible concentration (@ 2,5 x 10 6 billes / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Kit de détection des anticorps pour Biotinylation non modifiée </td></tr><tr><td> Tecan Infini F200 Lecteur </td><td> Tecan </td><td></td><td> Lecteur de plaque ELISA </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% du PBS-BSATampon de dosage, </td></tr><tr><td> Une pinte-Cleaner Compact ultrasons, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> Produire une fréquence de fonctionnement effective de 55 kHz </td></tr><tr><td> Séparateur magnétique Tube </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> Pour la séparation seul tube de 1,5 ml magnétique dans les étapes de lavage de couplage </td></tr><tr><td> Séparateur plaque magnétique </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Pour 96-ainsi la séparation plaque magnétique dans les étapes de lavage de dosage </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a longtemps été le principal outil pour la détection d&#39;analytes d&#39;intérêt dans des échantillons biologiques pour la recherche à la fois sciences de la vie et les diagnostics cliniques. Cependant, le test ELISA a ses limites. Il est généralement réalisé dans une microplaque de 96 puits, et les puits sont recouverts d&#39;anticorps de capture, ce qui nécessite une quantité relativement importante de l&#39;échantillon pour capturer un antigène d&#39;intérêt. La grande surface des puits et la liaison hydrophobe de l&#39;anticorps de capture peut également conduire à fond non spécifique contraignante et plus. En outre, la plupart des tests ELISA compter sur l&#39;intermédiaire d&#39;enzyme amplification du signal afin d&#39;obtenir une sensibilité raisonnable. D&#39;amplification telle n&#39;est pas toujours linéaire et peut fausser les résultats ainsi. Au cours des 15 dernières années, une nouvelle technologie a vu le jour qui offre les avantages de la technique ELISA, mais aussi permet un débit plus élevé, une plus grande souplesse, volume de l&#39;échantillon réduit, et à moindre coût, avec un wo similairerkflow 1, 2. Luminex xMAP de la technologie est une plate-forme de réseau de microsphères (billes) permettant à la fois monoplex et essais multiplex qui peuvent être appliquées à la fois des protéines et acides nucléiques applications 3-5. Les billes ont l&#39;anticorps de capture immobilisé de façon covalente sur une surface plus petite, ce qui nécessite moins anticorps de capture et les volumes d&#39;échantillons plus petites, par rapport à ELISA, et la liaison non spécifique est réduite de manière significative. Volumes d&#39;échantillons plus petits sont importantes lorsque l&#39;on travaille avec des échantillons limitant tels que le liquide céphalo-rachidien, du liquide synovial, etc 6. Multiplexage le dosage réduit encore le volume d&#39;échantillon exigences, permettant plusieurs résultats à partir d&#39;un seul échantillon. Les récentes améliorations de Luminex comprennent: le nouveau système MAGPIX, une plus petite, moins coûteuse, plus facile à utiliser l&#39;analyseur; faible concentration magnétique MagPlex microsphères qui éliminent le besoin de coûteux plaques filtrantes et viennent dans une concentration de travail mieux adapté pour le développement de tests et defaible débit demandes, et l&#39;anticorps xMAP accouplement (ABC) du kit qui comprend un protocole, les réactifs et produits consommables nécessaires pour coupler billes à l&#39;anticorps de capture d&#39;intérêt. (Voir la section Matériaux pour une liste détaillée du contenu du kit.) Dans cette expérience, nous convertissons un test pré-optimisée ELISA pour la cytokine TNF-alpha à ​​la plate-forme xMAP et comparer la performance des deux méthodes 7-11. TNF-alpha est un biomarqueur utilisé dans la mesure des réponses inflammatoires chez les patients souffrant de troubles auto-immunes. Nous commençons par le couplage quatre anticorps de capture candidats à quatre ensembles de microsphères ou des régions différentes. Lorsque mélangés, ces quatre ensembles de permettre l&#39;analyse simultanée de tous les quatre candidats ayant quatre anticorps de détection distinctes afin de déterminer la meilleure paire d&#39;anticorps, les réactifs d&#39;épargne, de l&#39;échantillon et le temps. Deux dosages xMAP sont ensuite construits avec les deux paires d&#39;anticorps les plus optimales et leur performance estpar rapport à celle du dosage ELISA originale en ce qui concerne la puissance du signal, la gamme dynamique, et la sensibilité.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Un test ELISA peut être facilement converti en un dosage Luminex xMAP et, grâce aux bienfaits de multiplexage, plusieurs anticorps peuvent être projetés simultanément pour identifier une paire d&#39;anticorps optimal, ce qui entraîne une sensibilité accrue et une gamme dynamique, tout en réduisant les coûts du test.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Microdissection laser des tissus de mammifères

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Recherche

Biologie

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Capturez cellule à l&#39;aide d&#39;un dispositif microfluidique

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Une méthode de sélection aptamères Structure commutation Appliqué à un colorimétrique Or nanoparticules Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...