Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
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Diese Arbeit wurde von Luminex Corporation finanziert.

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	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. 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Diese Arbeit wurde am Luminex Corporation mit Ausrüstung bei Luminex Corporation hergestellt getan. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore sind strategische Partner von Luminex Corporation, lizenziert zur Entwicklung und Vermarktung xMAP Multiplex Assays.

Die Umwandlung eines ELISA-Assays auf Basis der Luminex xMAP-Plattform kann so einfach sein wie Substitution Streptavidin Meerrettichperoxidase (SA-HRP) in einer typischen ELISA-Kit mit Streptavidin Phycoerythrin (SA-PE), und die Optimierung für die Leistung. Für diejenigen, die eine xMAP Immunoassay von Grund auf neu erstellen möchten, können dies mit einem einfachen Protokoll, das ermöglicht auch die schnelle, Multiplex-Auswertung der Antikörper-Paaren durchgeführt werden. Die Reagenzien für die xMAP Assay wurden leicht unter Verwendung des xMAP Antikörper Kupplungssatz zum Koppeln der Fänger-Antikörper bezeichnet, um MagPlex niedriger Konzentration Mikrokügelchen. Die Verwendung einer niedrigen Konzentration Mikrokügelchen verringert die Kosten der Assay-Entwicklung bei gleicher Testleistung höherer Konzentration Mikrokügelchen. Die Zeit, die erforderlich ist, um Mikrosphären gekoppelt MagPlex vorzubereiten, ist ca. 3 Stunden, das ist viel schneller als die 22 bis 24 Stunden erforderlich, um das Fell gut einer ELISA-Platte, gefolgt von einer Behandlungder beschichteten Vertiefungen. Die Leistung der xMAP-Versuch ist auch besser als der ELISA in Bezug auf die Nachweisgrenze (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / ml) und der dynamische Bereich (&lt;4 pg / ml bis&gt; 8000 pg / ml vs 16 pg / ml bis 1000 pg / ml). Tafel Software haben eine begrenzte OD Bereich, der entweder 3 oder 4, OD, beschränken die obere Grenze des dynamischen Bereichs für einen Assay. Zweifellos wird nicht alle Antikörper in einem ELISA-Format zu arbeiten und nicht alle Antikörper, die gut funktionieren in einem ELISA sind leicht übertragbar auf die xMAP-Assay-Format. Da jedoch xMAP Assays können gemultiplext (dh, gleichzeitig ausgeführt werden), ist es möglich, mehrere Abscheidung und Nachweis-Antikörper-Kombinationen gleichzeitig zu evaluieren, das beste Paar zu identifizieren, für einen Assay zu verwenden. Dieses Verfahren spart erheblich Zeit und Reagenzien im Vergleich zu dem ELISA-Verfahren Entwicklung, die auf der Auswertung eines Paares in einer Zeit ist begrenzt. Wenn zwei oder mehr Antikörper-Paare ausführen äquivalent; andere Parameter des Assays könnenals Eignung des Paares (z. B. Verfügbarkeit, Kosten, usw.) zu bestimmen. Neben der verbesserten Assay-Performance und Flexibilität mit der xMAP-Assay, gibt es auch erhebliche Kosteneinsparungen. Die empfohlene Menge des Antikörpers zur Beschichtung eines einzigen Vertiefung eine ELISA-Platte ist 400 ng erforderlich ist, während die Menge der Kügelchen in einer Vertiefung einer xMAP Assay verwendet liegt bei ca. 7,5 ng. Somit wird die Menge des Antikörpers für ein ELISA benötigt auch wird mehr als 50 Testergebnisse, wenn es in einer xMAP Assay verwendet. Für Anwendungen mit wertvollen Proben, xMAP hat auch einen erheblichen Vorteil. Das Volumen der Probe für den ELISA empfohlen ist 100 ul während das Volumen für die xMAP-Assay erforderlich, dass die Hälfte oder weniger sein können. Zusammenfassend ist die Umwandlung eines ELISA-Assays auf Basis der Luminex xMAP-Plattform unkompliziert, effizient und Kosten sparend, während die Herstellung eines Assays mit überlegener Dynamik und Sensibilität.

<table border="1"><tbody><tr><td> Beschreibung </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Menschliche TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA-Kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Enthält monoklonale und polyklonale Biotin-gekoppelten Antikörpern und rekombinanten TNF-α-Protein-Standard </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Fänger-Antikörper, Klon CH8820 </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin-gekoppelten Detektions-Antikörper, Klon AS1 </td></tr><tr><td> TNF-alpha-Protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinanten TNF-α-Protein-Standard </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> NOVUS </td><td> NBP1-50115 </td><td> Fänger-Antikörper, Klon 4H31 </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotin-gekoppelten Detektions-Antikörper, Klon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF-alpha-Protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Rekombinanten TNF-α-Protein-Standard </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Fänger-Antikörper, klonen 3C7.2 </td></tr><tr><td> Polyklonalen Antikörper gegen TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Kaninchen polyklonaler Antikörper-Erkennung </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> Moos </td><td> SAPE-001 </td><td> Fluoreszierenden Reporter-Reagenz für die Luminex xMAP-Test </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Xponent Software </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-Xponent </td><td> Luminex-Gerät </td></tr><tr><td> xMAP Antikörper-Kupplung (AbC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Beinhaltet EDC-Reagenz, Sulfo-NHS-Reagenz, Aktivierung, Waschpuffer, 1,5 ml Reaktionsgefäße und Einwegpipetten </td></tr><tr><td> MagPlex Microspheres, geringe Konzentration </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Kügelchen mit niedriger Konzentration (bei ​​2,5 x 10 6 Kügelchen / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinylierungskit für unmodifizierte Detektionsantikörper </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> ELISA-Reader </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assay-Puffer </td></tr><tr><td> One-Pint Kompakte Ultraschall-Reiniger, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> Produzieren Sie eine effektive Betriebsfrequenz von 55 kHz </td></tr><tr><td> Magnetische Rohr Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288 bis 01 </td><td> Für einzelne 1,5 ml Röhrchen magnetische Trennung in Kopplung Waschschritte </td></tr><tr><td> Magnetische Plattenphasentrenner </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269 bis 01 </td><td> Für 96-Well-Platte magnetischen Trennung in Assay-Waschschritte </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Die Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) ist seit langem das wichtigste Werkzeug für den Nachweis von Analyten in biologischen Proben für die biowissenschaftliche Forschung und klinische Diagnostik. Jedoch hat ELISA Einschränkungen. Es wird typischerweise in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, und die Vertiefungen werden mit Einfang-Antikörper beschichtet, die eine relativ große Menge an Probe, um ein Antigen von Interesse zu erfassen. Die große Oberfläche der Vertiefungen und die hydrophobe Bindung der Fänger-Antikörper können auch auf nicht-spezifische Bindung und erhöhten Hintergrund führen. Darüber hinaus verlassen sich die meisten ELISAs auf Enzym-vermittelte Verstärkung des Signals, um eine angemessene Empfindlichkeit zu erreichen. Eine solche Verstärkung ist nicht immer linear und kann somit die Ergebnisse verfälschen. In den vergangenen 15 Jahren hat eine neue Technologie bietet sich heraus, dass die Vorteile des ELISA, sondern ermöglicht auch einen höheren Durchsatz, höhere Flexibilität, geringere Probenvolumen und niedrigeren Kosten, mit einer ähnlichen WOrkflow 1, 2. Luminex xMAP-Technologie ist eine Mikrosphären (Perle) Array-Plattform ermöglicht sowohl Monoplex und Multiplex-Assays, die sowohl für Protein-und Nukleinsäure-Anwendungen 5.3 angewendet werden können. Die Perlen haben den Capture-Antikörper kovalent an eine kleinere Oberfläche immobilisiert, die weniger Capture-Antikörper und kleiner Probenvolumina, verglichen mit ELISA und nicht-spezifische Bindung wird deutlich reduziert. Kleinere Probenmengen sind wichtig bei der Arbeit mit Grenzmuster wie Cerebrospinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, etc. 6. Multiplexen der Test weiter reduziert Probenvolumen Anforderungen, so dass mehrere Ergebnisse aus einer einzigen Probe. Die jüngsten Verbesserungen von Luminex enthalten: die neue MAGPIX System, ein kleiner, billiger, einfacher zu bedienende Analysator; niedriger Konzentration Magnetic MagPlex Mikrokugeln, die den Bedarf an teuren Filterplatten eliminieren und kommen in einer Konzentration arbeiten besser für Assay-Entwicklung geeignet undLow-Throughput-Anwendungen, und die xMAP-Antikörper-Kupplung (AbC) Kit, das ein Protokoll, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die für Kupplung Perlen an den Fänger-Antikörper von Interesse enthält. (Siehe Abschnitt Materialien für eine detaillierte Liste der Inhalte der.) In diesem Experiment, setzen wir eine voroptimierte ELISA-Assay für TNF-alpha Zytokine an der xMAP-Plattform und die Performance der beiden Methoden 7-11. TNF-alpha als ein Biomarker bei der Messung von entzündlichen Reaktionen bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten verwendet. Wir beginnen mit der Kupplung vier Kandidaten Fänger-Antikörper zu vier verschiedene Mikrosphären-Sets oder Regionen. Wenn sie miteinander vermischt, erlauben diese vier Sätze für die gleichzeitige Prüfung aller vier Kandidaten mit vier getrennten Nachweis von Antikörpern gegen die besten Antikörper Paar, spart Reagenzien, Probe und Zeit zu bestimmen. Zwei xMAP Assays werden dann mit den beiden optimale Antikörper-Paare ausgebildet und ihre Wirkung istim Vergleich zu der ursprünglichen ELISA-Test in Bezug auf Signalstärke, Dynamikbereich und Empfindlichkeit.

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Ein ELISA kann leicht zu einem Luminex xMAP Assay umgewandelt werden und durch die Vorteile der Multiplexen mehrere Antikörper gleichzeitig gescreent werden, um eine optimale Antikörperpaar zu identifizieren, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit und den Dynamikbereich, während reduzierenden Assay einsehbar.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

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