Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי Luminex Corporation.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

עבודה זו נעשתה על Luminex חברת הציוד מיוצרים ב Luminex Corporation. R &amp; D מערכות &amp; EMD Millipore הם שותפים אסטרטגיים של Luminex Corporation; רישיון לפתח ולמסחר Xmap זמנית מבחני מבוסס.

המרה של assay ELISA לפלטפורמה Luminex Xmap יכול להיות פשוט כמו החלפת streptavidin peroxidase חזרת (SA-HRP) ב טיפוסית ערכת ELISA עם streptavidin phycoerythrin (SA-PE), ואופטימיזציה של הביצועים. למי שרוצה ליצור immunoassay Xmap מהיסוד, זה יכול להיות מושלם עם פרוטוקול ברור כי גם מאפשר הערכה מהירה, זמנית של זוגות נוגדנים. ריאגנטים לשנת assay Xmap היו מוכנים בקלות באמצעות נוגדן Xmap ערכת צימוד לזוג נוגדנים ללכוד המיועדים MagPlex microspheres ריכוז נמוך. השימוש microspheres ריכוז נמוך מפחית את העלות של פיתוח assay תוך מתן ביצועים assay אותו microspheres ריכוז גבוהה יותר. משך הזמן הנדרש כדי להכין יחד MagPlex microspheres הוא כ 3 שעות, שזה הרבה יותר מהר מאשר 22 - 24 שעות נדרש המעיל גם צלחת ELISA, ואחריו טיפולשל בארות מצופים. הביצועים של assay Xmap הוא גם עדיפה על ELISA מבחינת מגבלה של זיהוי (&lt;4 pg / mL לעומת&gt; 31 pg / mL) ודינמי טווח (&lt;4 pg / mL ל&gt; 8000 pg / mL לעומת 16 pg / mL עד 1000 pg / ml). קוראים פלייט יש מגוון מצומצם OD אשר הוא או 3 או 4 OD, להגביל את הגבול העליון של טווח דינמי assay. אין ספק, לא כל הנוגדנים יעבדו במתכונת ELISA ולא כל הנוגדנים שפועלים היטב ב ELISA ניתנות להעברה בקלות לתבנית assay Xmap. עם זאת, מאז מבחני Xmap ניתן מרובב (כלומר, להפעיל בו זמנית), ניתן להעריך ללכוד כמה שילובים ואת הנוגדנים לזיהוי במקביל לזהות את הצמד הטוב ביותר לשימוש עבור assay. תהליך זה חוסך זמן משמעותי ריאגנטים לעומת הליך פיתוח ELISA, אשר מוגבל להערכת זוג אחד בכל פעם. שניים או יותר זוגות הנוגדנים צריך לבצע שקול, פרמטרים אחרים של assay יכוללשקול לקבוע התאמתו של זוג (למשל, זמינות, עלות וכו &#39;). בנוסף לביצועים assay גמישות משופרת עם assay Xmap, יש גם חיסכון משמעותי בעלויות. כמות מומלצת של נוגדנים נדרש מעיל גם יחידה של צלחת ELISA היא 400ng, בעוד הכמות הדרושה של חרוזים המשמשים 1 היטב assay Xmap הוא כ 7.5 ננוגרם. לפיכך, כמות הנוגדנים הדרוש 1 ELISA גם תספק יותר מ -50 תוצאות הבדיקה, אם נעשה שימוש assay Xmap. עבור יישומים הכוללים דגימות יקרות, Xmap יש גם יתרון משמעותי. היקף המדגם מומלץ ELISA הוא 100 μL ואילו נפח הנדרש assay Xmap יכול להיות חצי מזה, או פחות. לסיכום, המרה של assay ELISA לפלטפורמה Luminex Xmap הוא לא מסובך, יעיל ועלות חיסכון, תוך הפקת assay עם טווח דינמי רגישות מעולה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תאור </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> האדם TNF-α/TNFSF1A DuoSet ערכת ELISA </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> DY210 </td><td> כולל חד שבטיים ו ביוטין נוגדנים polyclonal יחד ו רקומביננטי סטנדרטיים TNF-α חלבון </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> לכידת נוגדנים, שיבוט CH8820 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> ביוטין מצמידים נוגדן איתור, שיבוט AS1 </td></tr><tr><td> חלבון TNF אלפא </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> רקומביננטי TNF-α חלבון רגילה </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> לא זמיןovus </td><td> NBP1-50115 </td><td> לכידת נוגדנים, שיבוט 4H31 </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> נובוס </td><td> NB100-78162 </td><td> ביוטין מצמידים נוגדן איתור, שיבוט MAb11 </td></tr><tr><td> חלבון TNF אלפא </td><td> נובוס </td><td> NBC1-18460 </td><td> רקומביננטי TNF-α חלבון רגילה </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי כדי TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> לכידת נוגדנים, לשבט 3C7.2 </td></tr><tr><td> נוגדן Polyclonal כדי TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> איתור polyclonal הארנב נוגדן </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> אזוב </td><td> SAPE-001 </td><td> כתב מגיב פלורסנט עבור assay Xmap Luminex </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software xPONENT </td><td> Luminex Corporation </td><td> תואר שניGPIX-XPONENT </td><td> Luminex Instrument </td></tr><tr><td> Xmap נוגדן צימוד (ABC) ערכת </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> כולל מגיב EDC, Sulfo-NHS מגיב, מאגר ההפעלה, מאגר הכביסה, 1.5 התגובה צינורות מ&quot;ל, ו בטפי להחדרת נוזלים חד פעמיים </td></tr><tr><td> MagPlex microspheres, ריכוז נמוך </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> ריכוז נמוך חרוזים (@ 2.5 x 10 6 חרוז / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-ביוטין </td><td> תרמו פישר </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinylation ערכת זיהוי הנוגדן ללא שינוי </td></tr><tr><td> טקאן אינסופי F200 Reader </td><td> טקאן </td><td></td><td> ELISA צלחת הקורא </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assay Buffer </td></tr><tr><td> אחד פיינט נקיים קולי קומפקטי, 115 VAC </td><td> קולמן בן הזוג </td><td> WU-08849-00 </td><td> לייצר תדר הפעלה יעילה של kHz 55 </td></tr><tr><td> Tube מפריד מגנטי </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> להפרדה חד צינור 1.5mL המגנטי צעדים לשטוף צימוד </td></tr><tr><td> לוח מגנטי מפריד </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> להפרדה 96 היטב צלחת מגנטית בצעדים לשטוף assay </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Assay האנזים צמוד immunosorbent (ELISA) כבר זמן רב את הכלי העיקרי לגילוי של analytes של עניין דגימות ביולוגיות הן למחקר מדעי החיים ודיאגנוסטיקה קלינית. עם זאת, ELISA יש מגבלות. הדבר מתבצע בדרך כלל microplate 96-היטב, בארות מכוסים נוגדנים ללכוד, הדורש כמות גדולה יחסית של המדגם לתפוס אנטיגן של עניין. שטח פנים גדול של בארות מחייב הידרופובי של נוגדנים ללכוד יכול להוביל גם הרקע הלא ספציפית מחייב יותר. בנוסף, רוב ELISAs להסתמך על הגברה האנזים בתיווך של אות על מנת להשיג רגישות סבירה. הגברה כזו היא לא תמיד ליניארית תוצאות ולכן ניתן ליצור הטיה. ב -15 השנים האחרונות, התפתחה טכנולוגיה חדשה המציעה את היתרונות של ELISA, אך גם מאפשר קצב העברת נתונים גבוהה יותר, גמישות משופרת, נפח דגימה מופחת, ובעלות נמוכה יותר, עם וו דומהrkflow 1, 2. Luminex Xmap הטכנולוגיה היא (חרוז) microsphere מערך פלטפורמה המאפשרת הן monoplex ואת מבחני זמנית כי ניתן להחיל את החלבון הן חומצות גרעין ויישומים 3-5. החרוזים יש נוגדנים ללכוד משותקת קוולנטית על שטח פנים קטן יותר, המחייב נוגדנים ללכוד פחות כרכים מדגם קטן יותר, בהשוואה ל ELISA, ולא ספציפית מחייב מצטמצם משמעותית. כרכים מדגם קטנים יותר חשובים בעבודה עם דגימות מגבילות כמו הנוזל השדרתי, נוזל סינוביאלי, וכו &#39;6. ריבוב assay תצמצם עוד יותר את נפח דרישות לדוגמה, המאפשר מספר רב של תוצאות ממדגם אחד. שיפורים שנעשו לאחרונה על ידי Luminex כוללים: המערכת החדשה MAGPIX, קטן יותר, זול יותר, קל יותר לשימוש Analyzer, ריכוז נמוך מגנטי MagPlex microspheres אשר מבטל את הצורך צלחות הסינון יקרים לבוא בריכוז עובד מתאים יותר לפיתוח assay ונמוך התפוקה יישומים וכן את הצימוד נוגדן Xmap (ABC) קיט, הכולל פרוטוקול, חומרים כימיים, וחומרים מתכלים הדרושים צימוד חרוזים כדי נוגדנים לכידתו של עניין. (ראה סעיף חומרים לרשימה מפורטת של תכולת הערכה). בניסוי זה, אנו ממירים את assay מראש אופטימיזציה ELISA עבור ציטוקינים TNF-alpha לפלטפורמה Xmap ולהשוות את הביצועים של שתי השיטות 7-11. TNF-alpha הוא סמן ביולוגי המשמש למדידת תגובות דלקתיות בחולים עם מחלות אוטואימוניות. נתחיל צימוד ללכוד ארבעה נוגדנים מועמד ארבע קבוצות microsphere או אזורים שונים. כאשר מערבבים יחד, אלה ארבע קבוצות לאפשר בדיקות סימולטני של כל ארבעת המועמדים עם ארבעה נוגדנים זיהוי נפרדים כדי לקבוע זוג נוגדנים הטובה ביותר, ריאגנטים חיסכון, מדגם וזמן. שני מבחני Xmap בנויים כך עם שני זוגות נוגדנים האופטימלית ביותר והביצועים שלהםבהשוואה לזו של assay ELISA המקורי לגבי עוצמת האות, טווח דינמי, ורגישות.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

ELISA ניתן להמיר בקלות assay Luminex Xmap, ובאמצעות היתרונות של נוגדנים, ריבוב כמה יכול להיות מוקרן בו זמנית לזהות נוגדנים זוג אופטימלי, והתוצאה היא רגישות מוגברת טווח דינמי, תוך הפחתת עלות assay.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

אנטי גרעיני נוגדן הקרנה באמצעות הפ-2 תאים

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...