Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
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यह काम Luminex निगम द्वारा वित्त पोषित किया गया.

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	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. 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J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Luminex निगम Luminex निगम में निर्मित उपकरणों के साथ यह काम किया गया था. अनुसंधान एवं विकास सिस्टम और ईएमडी Millipore Luminex निगम के रणनीतिक भागीदार हैं, को विकसित करने और मल्टीप्लेक्स Xmap आधारित assays व्यवसायीकरण लाइसेंस.

एलिसा परख के Luminex Xmap मंच के रूपांतरण के है streptavidin phycoerythrin (SA पीई) के साथ एक ठेठ एलिसा किट में streptavidin हॉर्सरैडिश peroxidase (एसए एचआरपी) प्रतिस्थापन, और प्रदर्शन के लिए अनुकूलित के रूप में सरल किया जा सकता है. उन लोगों के लिए जो भूमि ऊपर से एक Xmap immunoassay बनाना चाहते हैं, यह एक सरल प्रोटोकॉल है कि यह भी तेजी से, प्रतिरक्षी जोड़े के मल्टीप्लेक्स मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है के साथ पूरा किया जा सकता है. Xmap परख के लिए अभिकर्मकों आसानी Xmap एंटीबॉडी युग्मन किट का उपयोग कर नामित कब्जा एंटीबॉडी जोड़े को MagPlex कम एकाग्रता की microspheres के लिए तैयार थे. कम एकाग्रता microspheres के उपयोग उच्च एकाग्रता microspheres की ही परख प्रदर्शन प्रदान करते हुए परख विकास की लागत कम कर देता है. समय की राशि के लिए मिलकर MagPlex microspheres तैयार करने की आवश्यकता लगभग 3 घंटे है, जो बहुत तेजी से 22 से 24 घंटे एक एलिसा थाली का अच्छी तरह से कोट करने के लिए आवश्यक उपचार के बादलेपित कुओं की. Xmap परख का प्रदर्शन भी पता लगाने की सीमा (&lt;4 स्नातकोत्तर / एमएल बनाम&gt; 31 / स्नातकोत्तर एमएल) और गतिशील श्रेणी (&lt;4 स्नातकोत्तर एमएल /&gt; 8000 / स्नातकोत्तर एमएल 16 बनाम के रूप में एलिसा से बेहतर है स्नातकोत्तर एमएल / 1000 स्नातकोत्तर / एमएल). प्लेट पाठकों को एक सीमित आयुध डिपो रेंज है जो या तो 3 या 4 आयुध डिपो, एक परख के लिए गतिशील रेंज की ऊपरी सीमा सीमित है. बेशक, नहीं सभी एंटीबॉडी एलिसा प्रारूप में काम और एंटीबॉडी कि एक एलिसा में अच्छी तरह से काम नहीं को Xmap परख प्रारूप करने के लिए आसानी से हस्तांतरणीय हैं. हालांकि, बाद से Xmap assays के (यानी, एक साथ चलाने के) में मल्टिप्लेक्स जा सकता है, यह संभव है कई को पकड़ने और पहचान प्रतिरक्षी संयोजन समवर्ती मूल्यांकन करने के लिए सबसे अच्छी जोड़ी की पहचान के लिए एक परख के लिए उपयोग. इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण समय और एलिसा विकास प्रक्रिया, जो एक समय में एक जोड़ी के मूल्यांकन के लिए सीमित है के लिए की तुलना में अभिकर्मकों बचाता है. दो या अधिक एंटीबॉडी जोड़े यों प्रदर्शन करना चाहिए, परख की अन्य पैरामीटर कर सकते हैंजोड़ी (उदाहरण के लिए, उपलब्धता, लागत, आदि) की उपयुक्तता का निर्धारण करने के लिए माना जाता है. सुधार परख और Xmap परख के साथ प्रदर्शन लचीलापन के अलावा, वहाँ भी महत्वपूर्ण लागत बचत कर रहे हैं. एंटीबॉडी की सिफारिश की मात्रा एक एकल अच्छी तरह से एक एलिसा थाली 400ng है कोट करने के लिए आवश्यक है, जबकि एक Xmap परख की अच्छी तरह से एक में इस्तेमाल किया मोती के लिए आवश्यक मात्रा लगभग 7.5 एनजी है. इस प्रकार, एंटीबॉडी की राशि एक एलिसा के लिए आवश्यक अच्छी तरह से 50 से अधिक परीक्षण के परिणाम प्रदान करते हैं, अगर Xmap परख में इस्तेमाल किया जाएगा. अनमोल नमूनों को शामिल अनुप्रयोगों के लिए, Xmap भी एक महत्वपूर्ण लाभ है. नमूना एलिसा के लिए सिफारिश की मात्रा 100 μL है जबकि Xmap परख के लिए आवश्यक मात्रा में है कि आधे, या कम किया जा सकता है. सारांश में, एक एलिसा परख की Luminex Xmap मंच रूपांतरण सीधी, कुशल और लागत बचत है, जबकि श्रेष्ठ गतिशील रेंज और संवेदनशीलता के साथ एक परख का निर्माण.

<table border="1"><tbody><tr><td> विवरण </td><td> विक्रेता </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> . मानव TNF-α/TNFSF1A DuoSet एलिसा किट </td><td> अनुसंधान एवं विकास सिस्टम </td><td> DY210 </td><td> को मोनोक्लोनल और बायोटिन मिलकर पॉलीक्लोनल प्रतिपिण्डों और पुनः संयोजक प्रोटीन TNF-α मानक शामिल हैं </td></tr><tr><td> TNF-α मोनोक्लोनल प्रतिपिण्ड </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> एंटीबॉडी पर कब्जा, CH8820 क्लोन </td></tr><tr><td> TNF-α मोनोक्लोनल प्रतिपिण्ड </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> बायोटिन मिलकर जांच एंटीबॉडी, क्लोन AS1 </td></tr><tr><td> TNF अल्फा प्रोटीन </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> पुनः संयोजक प्रोटीन TNF-α मानक </td></tr><tr><td> TNF-α मोनोक्लोनल प्रतिपिण्ड </td><td> एनovus </td><td> NBP1 - 50,115 </td><td> एंटीबॉडी पर कब्जा, क्लोन 4H31 </td></tr><tr><td> TNF-α मोनोक्लोनल प्रतिपिण्ड </td><td> Novus </td><td> NB100 - 78,162 </td><td> बायोटिन मिलकर जांच एंटीबॉडी, क्लोन MAb11 </td></tr><tr><td> TNF अल्फा प्रोटीन </td><td> Novus </td><td> NBC1 - 18,460 </td><td> पुनः संयोजक प्रोटीन TNF-α मानक </td></tr><tr><td> TNF-α मोनोक्लोनल प्रतिपिण्ड </td><td> ईएमडी Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> एंटीबॉडी कैप्चर 3C7.2 क्लोन </td></tr><tr><td> TNF-α पॉलीक्लोनल प्रतिपिण्ड </td><td> ईएमडी Millipore </td><td> ६५४२५० </td><td> खरगोश पॉलीक्लोनल जांच एंटीबॉडी </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> काई </td><td> SAPE - 001 </td><td> Luminex Xmap परख के लिए प्रतिदीप्त संवाददाता अभिकर्मक </td></tr><tr><td> MAGPIX / w Xponent सॉफ्टवेयर </td><td> Luminex निगम </td><td> एमएGPIX - Xponent </td><td> Luminex साधन </td></tr><tr><td> Xmap एंटीबॉडी युग्मन किट (एबीसी) </td><td> Luminex निगम </td><td> 40-50016 </td><td> EDC के अभिकर्मक, Sulfo एनएचएस अभिकर्मक, सक्रियण बफर, धो बफर, 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों, और प्रयोज्य pipettes शामिल </td></tr><tr><td> MagPlex microspheres, कम एकाग्रता </td><td> Luminex निगम </td><td> MC10012 आईडी, MC10013 आईडी, MC10014 आईडी, MC10015 आईडी </td><td> कम एकाग्रता मोती (2.5 10 x 6 मनका / एमएल) </td></tr><tr><td> ईज़ी - लिंक Sulfo एन एच एस-LC - बायोटिन </td><td> थर्मो फिशर </td><td> PI-21,335 </td><td> असंशोधित पता लगाने के एंटीबॉडी के लिए biotinylation किट </td></tr><tr><td> Tecan अनंत F200 रीडर </td><td> Tecan </td><td></td><td> एलिसा प्लेट रीडर </td></tr><tr><td> फास्फेट खारा बफर </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> पी - 3688 </td><td> % 1 पीबीएस-BSA, परख बफर </td></tr><tr><td> एक पिंट कॉम्पैक्ट अल्ट्रासोनिक क्लीनर, 115 VAC </td><td> कोल - परमार </td><td> Wu-08,849-00 </td><td> 55 kHz के एक प्रभावी ऑपरेटिंग आवृत्ति उत्पादन </td></tr><tr><td> चुंबकीय ट्यूब विभाजक </td><td> Luminex निगम </td><td> CN-0288-01 </td><td> युग्मन धोने कदम में एक 1.5mL ट्यूब चुंबकीय जुदाई के लिए में </td></tr><tr><td> चुंबकीय प्लेट विभाजक </td><td> Luminex निगम </td><td> CN-0269-01 </td><td> 96 अच्छी तरह से परख धोने चरणों में चुंबकीय थाली जुदाई के लिए </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

एक एलिसा आसानी से Luminex Xmap परख के करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है और बहुसंकेतन, कई एंटीबॉडी के लाभ के माध्यम से एक साथ जांच की जा सकती है के लिए एक इष्टतम प्रतिरक्षी जोड़ी की पहचान करने के लिए, वृद्धि की संवेदनशीलता और गतिशील रेंज में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि लागत को कम करने परख.

एक कैप्चर एलिसा के Luminex Xmap परख एक मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी स्क्रीनिंग विधि का उपयोग करने के लिए रूपांतरण

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

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