Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
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Questo lavoro è stato finanziato da Luminex Corporation.

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	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. 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Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Questo lavoro è stato fatto a Luminex Corporation con attrezzature prodotti presso Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore sono partner strategici di Luminex Corporation, la licenza per sviluppare e commercializzare saggi xMAP basati multiplex.

La conversione di un saggio ELISA per la piattaforma Luminex xMAP può essere semplice come sostituzione streptavidina perossidasi di rafano (HRP-SA) in una tipica kit ELISA con streptavidina ficoeritrina (SA-PE), e per ottimizzare le prestazioni. Per coloro che vogliono creare un immunodosaggio xMAP dalla terra in su, questo può essere realizzato con un protocollo semplice che consente anche il digiuno, la valutazione multiplex delle coppie di anticorpi. I reagenti per il dosaggio xMAP erano facilmente preparati usando il kit anticorpo xMAP accoppiamento per accoppiare gli anticorpi di cattura designati a concentrazione microsfere MagPlex basso. L&#39;uso di microsfere concentrazione bassa riduce il costo di sviluppo test fornendo le stesse prestazioni di dosaggio microsfere concentrazione superiore. La quantità di tempo necessario per preparare accoppiato MagPlex microsfere è di circa 3 ore, che è molto più veloce del 22 - 24 ore necessario per rivestire il pozzetto di una piastra ELISA, seguita dal trattamentodei pozzetti. Le prestazioni del dosaggio xMAP è anche superiore al ELISA in termini di limite di rilevamento (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / mL) e gamma dinamica (&lt;4 pg / mL a&gt; 8000 pg / ml vs 16 pg / mL a 1000 pg / mL). Lettori di piastre hanno una gamma limitata OD che è 3 o 4 OD, limitando il limite superiore della gamma dinamica per un saggio. Indubbiamente, non tutti gli anticorpi funzionano in un formato ELISA e non tutti gli anticorpi che funzionano bene in un test ELISA sono facilmente trasferibili al formato del saggio xMAP. Tuttavia, poiché i saggi xMAP possono essere multiplati (cioè, funzionare simultaneamente), è possibile valutare diverse cattura e combinazioni anticorpo di rivelazione simultaneamente per identificare il miglior coppia di utilizzare per un saggio. Questo processo consente di risparmiare molto tempo e reagenti rispetto alla procedura ELISA sviluppo, che è limitata alla valutazione di una coppia alla volta. Se due o più coppie di anticorpi di eseguire in modo equivalente; altri parametri del test puòconsiderati per determinare l&#39;idoneità della coppia (ad esempio, la disponibilità, costo, ecc). Oltre a migliorare le prestazioni del dosaggio e la flessibilità con il saggio xMAP, ci sono anche significativi risparmi sui costi. La quantità consigliata di anticorpi necessari per rivestire un singolo pozzo di una piastra ELISA è 400ng, mentre la quantità necessaria per le perline utilizzate in un pozzetto di un saggio xMAP è di circa 7,5 ng. Pertanto, la quantità di anticorpo necessaria per un ELISA e fornirà più di 50 risultati del test, se usato in un saggio xMAP. Per le applicazioni che coinvolgono i campioni preziosi, xMAP ha anche un vantaggio significativo. Il volume di campione raccomandato per l&#39;ELISA è 100 pl, mentre il volume richiesto per il test xMAP può essere metà, o meno. In sintesi, la conversione di un saggio ELISA per la piattaforma Luminex xMAP è semplice, efficiente ed economico, producendo un saggio con una gamma dinamica e sensibilità.

<table border="1"><tbody><tr><td> Descrizione </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Umano TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Comprende anticorpi monoclonali accoppiati e biotina policlonali e ricombinante standard di TNF-α proteina </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonale anti TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Anticorpo di cattura, clone CH8820 </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonale anti TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Coniugato con biotina Detection, clone AS1 </td></tr><tr><td> TNF alfa proteine </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Ricombinante TNF-α proteina standard </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonale anti TNF-α </td><td> NOVUS </td><td> NBP1-50115 </td><td> Anticorpo di cattura, clone 4H31 </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonale anti TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Coniugato con biotina Detection, clone MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alfa proteine </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Ricombinante TNF-α proteina standard </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonale anti TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Anticorpo di cattura, clonare 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticorpo policlonale di TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Anticorpo di coniglio policlonale di rilevamento </td></tr><tr><td> Streptavidina-ficoeritrina </td><td> Muschio </td><td> SAPE-001 </td><td> Giornalista reagente fluorescente per Assay Luminex xMAP </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software Xponent </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPix-Xponent </td><td> Strumento Luminex </td></tr><tr><td> xMAP anticorpi Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Include reagente EDC, solfo-NHS reattivo, buffer di attivazione, tampone di lavaggio, provette da 1,5 ml di reazione, e pipette monouso </td></tr><tr><td> MagPlex Microsfere, bassa concentrazione </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Perle di bassa concentrazione (@ 2,5 x 10 6 tallone / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link solfo-NHS-LC-biotina </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Kit biotinilazione per gli anticorpi di rilevazione non modificata </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> Lettore di piastra ELISA </td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% BSA-PBS, Assay Buffer </td></tr><tr><td> One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> Produrre una frequenza effettiva di funzionamento di 55 kHz </td></tr><tr><td> Tubo separatore magnetico </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> Per singola provetta da 1,5 ml di separazione magnetica in fasi di lavaggio di accoppiamento </td></tr><tr><td> Piastra di separazione magnetica </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Per le 96 e piastra di separazione magnetica in fasi di lavaggio del test </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

L&#39;enzima-test immunoenzimatico (ELISA) è stato a lungo il principale strumento per la rilevazione di analiti di interesse in campioni biologici sia per la ricerca delle scienze della vita e la diagnostica clinica. Tuttavia, ELISA ha dei limiti. Esso è tipicamente effettuata in una micropiastra da 96 pozzetti, ed i pozzetti sono rivestite con anticorpo di cattura, che richiede una quantità relativamente grande di campione per catturare un antigene di interesse. L&#39;ampia superficie dei pozzetti e il legame di anticorpo di cattura idrofobo può anche portare a non specifico sfondo legame e maggiore. Inoltre, la maggior parte ELISA invocare mediata da enzimi amplificazione del segnale al fine di ottenere una sensibilità ragionevole. Tale amplificazione non è sempre lineare e può risultati così skew. Negli ultimi 15 anni, una nuova tecnologia è emerso che offre i vantaggi del test ELISA, ma anche permette un throughput più elevato, maggiore flessibilità, volume del campione ridotto e costi inferiori, con un wo similerkflow 1, 2. Luminex xMAP Technology è una (tallone), piattaforma di array di microsfere permettendo sia monoplex e saggi di multiplex che possono essere applicati sia per applicazioni di proteine ​​e acidi nucleici 3-5. Le perle hanno l&#39;anticorpo di cattura immobilizzato covalentemente su una superficie più piccola, richiedendo meno anticorpo di cattura e piccoli volumi di campione, rispetto alla ELISA, e il legame non specifico è significativamente ridotta. Piccoli volumi di campione sono importanti quando si lavora con campioni limite come liquido cerebrospinale, liquido sinoviale, ecc 6. Multiplexing del dosaggio riduce ulteriormente i requisiti di volume del campione, consentendo di raggiungere risultati multipli da un singolo campione. Recenti miglioramenti di Luminex sono: il nuovo sistema MAGPIX, uno più piccolo, meno costoso, più facile da usare analizzatore, a bassa concentrazione magnetica MagPlex Microsfere che eliminano la necessità di costosi e piastre filtranti sono disponibili in una concentrazione di lavoro più adatto per lo sviluppo del test elow-throughput delle applicazioni e l&#39;anticorpo xMAP Coupling (ABC) del kit, che comprende un protocollo, reagenti e materiali di consumo necessari per l&#39;accoppiamento perline per l&#39;anticorpo di cattura di interesse. (Vedere la sezione Materiali per un elenco dettagliato del contenuto del kit.) In questo esperimento, si convertire un pre-ottimizzato saggio ELISA per il TNF-alfa citochina alla piattaforma xMAP e confrontare le prestazioni dei due metodi 7-11. TNF-alfa è un biomarker utilizzato nella misurazione delle risposte infiammatorie in pazienti con disturbi autoimmuni. Cominciamo con l&#39;accoppiamento di anticorpi di cattura quattro candidati a quattro differenti set di microsfere o regioni. Quando miscelati insieme, questi quattro insiemi consentire la prova simultanea di tutti i quattro candidati con quattro anticorpi rilevamento separato per determinare la coppia migliore anticorpo, reagenti risparmio, campione e il tempo. Due saggi xMAP vengono costruiti con le due coppie di anticorpi più ottimali e la loro performance èrispetto a quella originale del saggio ELISA per quanto riguarda la potenza del segnale, gamma dinamica, e la sensibilità.

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Un ELISA può essere facilmente convertito in un saggio Luminex xMAP e, attraverso i benefici di multiplexing, diversi anticorpi possono essere proiettati contemporaneamente per identificare una coppia ottimale anticorpo, con conseguente aumento della sensibilità e gamma dinamica, riducendo i costi dosaggio.

Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

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