Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
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この作品は、ルミネックス·コーポレーションによって資金を供給された。

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	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. 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J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

この作品は、ルミネックス·コーポレーションで製造装置をルミネックス·コーポレーションで行われた。 R＆Dシステム＆EMDミリポアルミネックス·コーポレーションの戦略的パートナーであり、多重XMAPベースのアッセイを開発し、実用化するためにライセンスされています。

ルミネックスXMAPプラットフォームへのELISAアッセイの変換はストレプトアビジンフィコエリスリン（SA-PE）の典型的なELISAキットにストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP）を代入すると、パフォーマンスを最適化するような単純なことができます。地面からXMAPイムノアッセイを作成したい人のために、これはまた、抗体ペアの高速、多重評価を可能にする簡単なプロトコルを使用して達成することができます。 XMAPアッセイ用試薬は、簡単にMagPlex低濃度微小球に結合するように指定された捕捉抗体のキットをカップリングXMAP抗体を用いて調製した。より高濃度のマイクロスフェアの同じアッセイの性能を提供しながら、低濃度微小球の使用は、アッセイ開発のコストを削減します。コー​​トにELISAプレートのウェルを必要とし、24時間、治療に続いて - 結合MagPlexミクロスフェアを調製するために必要な時間は、はるかに高速22よりも約3時間であり、コー​​ティングされた井戸の。 XMAPアッセイの性能は、検出限界の点でELISA（&lt;4 pg / mLの対&gt; 31 pg / mLの）とダイナミック·レンジ（8000 pg / mLの対16 &lt;〜4 pg / mLの&gt;に優れているpg / mLの1000〜pg / mLの）。プレートリーダーは、アッセイのダイナミックレンジの上限を制限し、3または4 ODである限られたODの範囲を持っています。 間違いなく、すべての抗体は、ELISAフォーマットで動作し、ELISA法ではうまく動作しないすべての抗体は、XMAPアッセイフォーマットに容易に譲渡することはできません。 XMAPアッセイ（すなわち、同時に実行される）多重化することができますしかし、それは、アッセイに使用するための最良のペアを識別するために、同時に複数の捕捉および検出抗体の組み合わせを評価することが可能である。このプロセスは、一度に1つのペアの評価に限定されているELISAの開発手順に比べてかなりの時間と試薬を節約できます。二つ以上の抗体ペアは等価的に実行する必要があります。アッセイのその他のパペア（たとえば、可用性、コスト等）の適合性を決定するために考慮される。 XMAPアッセイに改良されたアッセイのパフォーマンスと柔軟性に加えて、大幅なコスト削減もあります。 XMAPアッセイの1つのウェルで使用されているビーズのために必要な量は約7.5 ngのであるのに対し、抗体の推奨量は、コート、単一のウェルELISAプレートは400ngであるために必要。 XMAPアッセイで使用されている場合このように、1つのウェルELISAに必要な抗体の量は、50以上のテスト結果を提供します。貴重なサンプルを含むアプリケーションでは、XMAPも大きな利点があります。 XMAPアッセイに必要な量はその半分、または少なくすることができます一方、ELISAのために推奨されるサンプルの量は100μLです。 優れたダイナミックレンジと感度を持つアッセイを製造しながら要約すると、ルミネックスXMAPプラットフォームへのELISAアッセイの変換は、単純な効率的でコスト節約になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 説明 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>人間TNF-α/TNFSF1ADuoSet ELISAキット</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> DY210 </td><td>モノクローナル抗体およびビオチン結合ポリクローナル抗体、組換えTNF-αタンパク質の標準が含まれています</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td>アブカム</td><td> Ab18696 </td><td>抗体、クローンCH8820をキャプチャする</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td>アブカム</td><td> Ab16166 </td><td>ビオチン結合の検出抗体、クローンAS1 </td></tr><tr><td> TNFアルファタンパク質</td><td>アブカム</td><td> Ab9642 </td><td>組換えTNF-αタンパク質の標準</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td>抗体、クローン4H31をキャ​​プチャする</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td>ノーバス</td><td> NB100-78162 </td><td>ビオチン結合の検出抗体、クローンMAb11 </td></tr><tr><td> TNFアルファタンパク質</td><td>ノーバス</td><td> NBC1-18460 </td><td>組換えTNF-αタンパク質の標準</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td> EMDミリポア</td><td> MAB1141 </td><td>抗体、クローン3C7.2をキャプチャする</td></tr><tr><td> TNF-αに対するポリクローナル抗体</td><td> EMDミリポア</td><td> 654250 </td><td>ウサギポリクローナル検出抗体</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン - フィコエリスリン</td><td>モス</td><td> SAPE-001 </td><td>ルミネックスXMAPアッセイ用蛍光レポーター試薬</td></tr><tr><td> MAGPIX W / Xponentのソフトウェア</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> MAGPIX-Xponentの</td><td>ルミネックス·インストゥルメント</td></tr><tr><td> XMAP抗体カップリング（ABC）キット</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> 40-50016 </td><td> EDC試薬、スルホ-NHS試薬、活性化バッファー、洗浄バッファー、1.5 mLの反応管と、使い捨てのピペットが含まれています</td></tr><tr><td> MagPlexミクロスフェア、低濃度</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> MC10012-ID、MC10013-ID、MC10014-ID、MC10015-ID </td><td>低濃度のビーズ（@ 2.5×10 6ビーズ/ mL）を</td></tr><tr><td> EZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチン</td><td>サーモフィッシャー</td><td> PI-21335 </td><td>変更されていない検出抗体のビオチン化キット</td></tr><tr><td>テカン無限F200リーダー</td><td>テカン</td><td></td><td> ELISAプレートリーダー</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P-3688 </td><td> 1パーセントPBS-BSA、アッセイ緩​​衝液</td></tr><tr><td>ワンパイントコンパクトな超音波洗浄、115 VAC </td><td>コー​​ル·パーマー</td><td> WU-08849から00 </td><td> 55 kHzの効果的な動作周波数を生成する</td></tr><tr><td>磁気チューブセパレータ</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> CN-0288から01 </td><td>カップリングの洗浄ステップ内の単一の1.5mlチューブ磁気分離</td></tr><tr><td>磁性板セパレータ</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> CN-0269から01 </td><td>アッセイの洗浄ステップで96ウェルプレート磁気分離</td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

酵素免疫測定法（ELISA）は、長い生命科学の研究と臨床診断の両方の生体試料中の関心のある検体を検出するための主要なツールであった。しかし、ELISA法では限界があります。これは通常、96ウェルマイクロプレートに実行され、井戸は、目的の抗原を捕捉するサンプルの比較的大きな金額を必要とし、捕捉抗体でコーティングされています。井戸の表面積が大きく捕捉抗体の疎水結合には、非特異的結合と増加の背景につながる可能性があります。また、ほとんどのELISA法は、合理的な感度を達成するために、信号の酵素媒介増幅に依存しています。このような増幅は常に線形ではないとすることができますので、スキュー結果。 過去15年間で、新技術は、ELISAの利点を提供している現れではなく、類似したWOより高いスループット、柔軟性、縮小サンプル量、低コストを可能にしましたrkflow 1、2。ルミネックスXMAPテクノロジーは、タンパク質および核酸アプリケーション3から5の両方に適用することができるモノプレックスとマルチプレックスアッセイの両方を可能にするマイクロスフェア（ビーズ）アレイのプラットフォームです。ビーズELISA法に比べて、少ない捕獲抗体と小さなサンプル量を必要とする共有結合より小さい表面積上に固定化された捕捉抗体を持っており、非特異的結合が大幅に削減されます。そのような脳脊髄液、滑液、等6などの制限のサンプルを扱う場合より小さいサンプルボリュームが重要である。検定の多重化は、さらに、単一のサンプルから複数の結果を有効にすると、サンプルボリュームの要件を軽減します。 ルミネックスの最近の改良点は次のとおりです。新しいMAGPIXシステムは、小型で安価な、より使いやすいアナライザ、低濃度の磁気MagPlexミクロス高価なフィルタープレートの必要性を排除し、優れたアッセイ開発に適した作業濃度に来て、低スループットのアプリケーション、およびXMAP抗体カップリング（ABC）キット、プロトコル、試薬、および利息の捕捉抗体ビーズを結合するために必要な消耗品が含まれています。 （キット内容の詳細なリストについては、マテリアルのセクションを参照してください。） この実験では、XMAPプラットフォームにTNF-αサイトカインの事前最適化されたELISAアッセイを変換し、二つの方法7-11の性能を比較します。 TNF-αは自己免疫疾患患者における炎症反応の測定に使用されるバイオマーカーである。 我々は、4つの異なるマイクロセットまたは領域に4つの候補捕捉抗体を結合することによって開始します。一緒に混合したときに、これら4つのセットには、試薬、サンプルと時間を節約し、最高の抗体のペアを決定するための4つの独立した検出抗体を持つすべての4つの候補の同時テストが可能になります。二XMAPアッセイは、2つの最適な抗体のペアとその性能がで構成されている信号の強さ、ダイナミックレンジ、感度に関しては、元のELISAアッセイのそれと比較されます。

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

ELISAは、簡単にルミネックスXMAPアッセイに変換することができると、多重化の利点を介して、いくつかの抗体は、アッセイのコストを削減しながら、増加した感度とダイナミックレンジの結果、最適な抗体のペアを識別するために同時にスクリーニングすることができる。

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

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Research

JoVE Journal

Biology

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