Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Luminex Corporation.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Dette arbeidet ble gjort på Luminex Corporation med utstyr produsert på Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore er strategiske partnere i Luminex Corporation, lisensiert til å utvikle og kommersialisere multiplekse xMAP baserte analyser.

Konverteringen av en ELISA-analysen til Luminex xMAP plattformen kan være så enkelt som å erstatte streptavidin pepperrot peroksidase (SA-HRP) i en typisk ELISA kit med streptavidin phycoerythrin (SA-PE), og optimalisere for ytelse. For de som ønsker å skape en xMAP immunoassay opp fra grunnen, kan dette gjøres med en enkel protokoll som også muliggjør rask, multipleks evaluering av antistoff par. Reagensene for xMAP analysen ble lett utarbeidet etter den xMAP Antistoff Kobling kit til par utpekte fangst antistoffer mot MagPlex lav konsentrasjon mikrosfærer. Bruk av lav konsentrasjon mikrosfærer reduserer kostnadene ved analysen utvikling samtidig som det gir den samme analysen ytelsen høyere konsentrasjon mikrosfærer. Tiden som kreves for å forberede kombinert MagPlex mikrosfærer er ca 3 timer, noe som er mye raskere enn 22 - 24 timer er nødvendig å belegge godt av en ELISA-plate, etterfulgt av behandlingav belagte brønner. Utførelsen av xMAP analysen er også overlegen til ELISA i form av deteksjonsgrensen (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / ml) og dynamisk rekkevidde (&lt;4 pg / ml til&gt; 8000 pg / ml vs 16 pg / ml til 1000 pg / ml). Plate leserne har en begrenset OD serie som er enten 3 eller 4 OD, begrenser den øvre grensen av det dynamiske området for en analyse. Utvilsomt vil ikke alle antistoffer jobbe i en ELISA-format og ikke alle antistoffer som fungerer godt i en ELISA er lett overførbar til xMAP analysen format. Men siden xMAP analyser kan multiplekset (dvs. kjøre samtidig), er det mulig å evaluere flere fangst og oppdagelse antistoff kombinasjoner samtidig å identifisere de beste paret å bruke for en analyse. Denne prosessen sparer betydelig tid og reagenser i forhold til ELISA utvikling prosedyren, som er begrenset til evaluering av ett par av gangen. Skulle to eller flere antistoff par utføre ekvivalent; andre parametere for analysen kananses for å avgjøre hvorvidt paret (f.eks tilgjengelighet, pris, etc.). I tillegg til forbedret analysen ytelse og fleksibilitet med xMAP analysen, er det også betydelige kostnadsbesparelser. Den anbefalte mengden av antistoff er nødvendig å belegge en enkelt brønn av en ELISA-plate er 400ng, mens mengden som kreves for perlene som brukes i en brønn av en xMAP analysen er ca 7,5 ng. Dermed mengden av antistoff som kreves for en ELISA brønn vil gi mer enn 50 testresultatene, hvis de brukes i en xMAP analysen. For søknader som involverer dyrebare prøver, har xMAP også en betydelig fordel. Volumet av prøven anbefales for ELISA er 100 mL mens volumet som kreves for xMAP analysen kan være halvparten av det, eller mindre. I sammendraget, er konvertering av en ELISA-analysen til Luminex xMAP plattformen ukomplisert, effektiv og kostnadsbesparende, mens produsere en analyse med overlegen dynamikk og følsomhet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Beskrivelse </td><td> Selger </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Menneskelig TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Inkluderer monoklonale og biotin koblede polyklonale antistoffer og rekombinant TNF-α protein standard </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistoff mot TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Fang antistoff, klone CH8820 </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistoff mot TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin koblet Detection antistoff, klone AS1 </td></tr><tr><td> TNF alfa protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinant TNF-α protein standard </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistoff mot TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Fang antistoff, klone 4H31 </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistoff mot TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotin koblet Detection antistoff, klone MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alfa protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Rekombinant TNF-α protein standard </td></tr><tr><td> Monoklonalt antistoff mot TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Fang antistoff, klone 3C7.2 </td></tr><tr><td> Polyklonale antistoff mot TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Rabbit polyklonal Detection Antibody </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> Moss </td><td> SAPE-001 </td><td> Fluoriserende reporter reagens for Luminex xMAP Assay </td></tr><tr><td> MAGPIX w / xPONENT Software </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Luminex Instrument </td></tr><tr><td> xMAP Antistoff Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Inkluderer EDC reagens, Sulfo-NHS reagens, aktivering buffer, vaskebuffer, 1,5 ml reaksjon rør, og disponibel pipetter </td></tr><tr><td> MagPlex Mikrokuler, lav konsentrasjon </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Lav konsentrasjon perler (@ 2,5 x 10 6 perle / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinylation kit for umodifisert deteksjon antistoff </td></tr><tr><td> TECAN Infinite F200 Reader </td><td> TECAN </td><td></td><td> ELISA plateavleseren </td></tr><tr><td> Fosfatbufret Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assay Buffer </td></tr><tr><td> One-Pint Compact ultrasoniske renere, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> Produsere en effektiv drifts frekvens på 55 kHz </td></tr><tr><td> Magnetic Tube Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> For enkelt 1.5mL tube magnetisk separasjon i koblingsdelene vaske trinn </td></tr><tr><td> Magnetic Plate Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> For 96-brønnen plate magnetisk separasjon i analysen vaske trinn </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Enzymet-koblede immunsorbent analyse (ELISA) har lenge vært det viktigste verktøyet for påvisning av analytter av interesse i biologiske prøver for både livet forskning og klinisk diagnostikk. Imidlertid har ELISA begrensninger. Det er vanligvis utført i en 96-brønns mikroplate, og brønnene er belagt med fangst antistoff, som krever en relativt stor mengde prøve å fange en antigen av interesse. Det store arealet av brønner og hydrofobe binding av fangst antistoff kan også føre til ikke-spesifikk binding og økt bakgrunn. I tillegg fleste ELISAs avhengige av enzymet-mediert forsterkning av signal for å oppnå rimelig følsomhet. Slik forsterkning er ikke alltid lineær og kan dermed skew resultater. I de siste 15 årene har en ny teknologi dukket som gir fordelene ved ELISA, men også gir høyere gjennomstrømning, økt fleksibilitet, redusert prøvevolum, og lavere kostnad, med en lignende wo1 rkflow, to. Luminex xMAP Technology er en mikrosfære (perle) matrise plattformen muliggjør både monoplex og multiplekse analyser som kan brukes til både protein og nukleinsyre applikasjoner 3-5. Perlene har fangst antistoffet kovalent immobilisert på et mindre areal, som krever mindre fangst antistoff og mindre prøvevolumer, sammenlignet med ELISA, og ikke-spesifikk binding er betydelig redusert. Mindre prøvevolumer er viktig når man arbeider med å begrense prøver som cerebrospinalvæske, leddvæsken, etc. 6. Multipleksing analysen reduserer ytterligere prøvevolum krav, slik at flere resultater fra en enkelt prøve. Nylige forbedringer av Luminex inkluderer: den nye MAGPIX systemet, en mindre, rimeligere, enklere å bruke instrument; Low-Konsentrasjon Magnetic MagPlex Mikrokuler som eliminerer behovet for kostbare filter plater og kommer i en arbeidsgruppe konsentrasjon bedre egnet for analysen utvikling oglav gjennomstrømning, og det xMAP Antistoff Coupling (ABC) Kit, som inkluderer en protokoll, reagenser og forbruksmateriell nødvendig for kobling perler til fangst antistoff av interesse. (Se Materialer seksjon for en detaljert liste over kit innhold.) I dette forsøket, konverterer vi en pre-optimalisert ELISA-analysen for TNF-alfa cytokin til xMAP plattformen og sammenligne resultatene av de to metodene 7-11. TNF-alfa er en biomarkør som brukes ved måling av inflammatoriske responser hos pasienter med autoimmune sykdommer. Vi begynner ved å koble fire kandidat fangst antistoffer mot fire forskjellige mikrosfære sett eller regioner. Når det blandes sammen har disse fire settene tillate samtidig testing av alle fire kandidater med fire separate brannvarslere antistoffer for å finne den beste antistoff par, lagring reagenser, utvalg og tid. To xMAP analysene blir deretter konstruert med de to mest optimale antistoff par og deres prestasjoner ersammenlignet med den opprinnelige ELISA-analysen i forhold til signalstyrke, dynamisk omfang, og følsomhet.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

En ELISA kan enkelt konverteres til en Luminex xMAP analysen og gjennom fordelene ved multipleksing, flere antistoffer kan være skjermet samtidig for å identifisere en optimal antistoff par, noe som resulterer i økt følsomhet og dynamisk omfang, og samtidig redusere analysen kostnad.

Konvertering av en Capture ELISA til en Luminex xMAP Assay bruker en Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluoriserende Screening Assay for å identifisere modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase Affinity Capture Assay hjelp av magnetiske perler å studere protein-Protein Interaction: Den poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Høy gjennomstrømming Funksjonell Screening ved hjelp av en hjemmelaget Dual-glød Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-Nuclear antistoff screening med HEp-2 celler

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metode for å velge Struktur-bytte aptamerer Anvendt til en Colorimetric Gold Nanopartikkel analysen

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifisering av kinase-substrat Pairs Bruke Høy throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...