Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
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Este trabalho foi financiado pela Luminex Corporation.

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	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. 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Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Este trabalho foi feito em Luminex Corporation com equipamentos fabricados no Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore são parceiros estratégicos da Luminex Corporation; licenciada para desenvolver e comercializar ensaios multiplex xMAP base.

A conversão de um ensaio de ELISA para a plataforma xMAP Luminex pode ser tão simples como a substituição de estreptavidina peroxidase de rábano (SA-HRP) em um típico kit de ELISA com estreptavidina ficoeritrina (SA-PE), e optimizar o desempenho. Para aqueles que deseja criar um imunoensaio xMAP de baixo para cima, isto pode ser realizado com um protocolo simples, que também permite a avaliação multiplex rápido, um dos pares de anticorpos. Os reagentes para o ensaio xMAP foram facilmente preparado utilizando o kit de Anticorpo xMAP acoplamento para acoplar os anticorpos de captura designados para MagPlex baixa concentração microesferas. O uso de baixa concentração de microesferas reduz o custo do desenvolvimento do ensaio enquanto fornece o desempenho do ensaio mesmo de maior concentração microesferas. A quantidade de tempo necessário para preparar acoplado MagPlex microesferas é de aproximadamente 3 horas, o que é muito mais rápido do que o 22 - 24 horas necessário para revestir o poço de uma placa de ELISA, seguido de tratamentodos poços revestidos. O desempenho do ensaio xMAP é também superior ao ELISA em termos de limite de detecção (&lt;4 pg / mL vs&gt; 31 pg / mL) e gama dinâmica (&lt;4 pg / mL a&gt; 8000 pg / mL vs 16 pg / mL a 1000 pg / mL). Leitores de placas têm uma gama limitada OD que é 3 ou 4 OD, restringindo o limite superior da gama dinâmica para um ensaio. Sem dúvida, nem todos os anticorpos vai trabalhar em um formato de ELISA e nem todos os anticorpos que funcionam bem em um ELISA são facilmente transferíveis para o formato de ensaio xMAP. No entanto, uma vez que os ensaios xMAP podem ser multiplexados (isto é, executar simultaneamente), é possível avaliar a captura e várias combinações de anticorpos de detecção em simultâneo para identificar a melhor par a ser usado para um ensaio. Este processo poupa tempo significativo e reagentes em comparação com o processo de desenvolvimento de ELISA, que é limitado para a avaliação de um par de cada vez. No caso de dois ou mais pares de anticorpos realizar equivalentemente; outros parâmetros do ensaio podeser considerado para determinar a adequação do par (por exemplo, a disponibilidade, custo, etc.) Além disso para o desempenho do ensaio melhorado e flexibilidade com o ensaio xMAP, há também poupanças de custos significativas. A quantidade recomendada de anticorpo necessária para revestir um único poço de uma placa de ELISA é 400ng, enquanto que a quantidade requerida para as esferas utilizadas em um poço de um ensaio de xMAP é aproximadamente 7,5 ng. Assim, a quantidade de anticorpo necessária para um ELISA bem irá fornecer mais de 50 resultados do teste, se for utilizado num ensaio xMAP. Para aplicações que envolvam amostras preciosos, xMAP também tem uma vantagem significativa. O volume da amostra recomendado para o ELISA é de 100 L ao passo que o volume necessário para o ensaio xMAP pode ser metade do que, ou menos. Em resumo, a conversão de um ensaio de ELISA para a plataforma xMAP Luminex é simples, eficiente e de economia de custos, enquanto a produção de um ensaio com uma gama dinâmica superior e sensibilidade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Descrição </td><td> Vendedor </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Inclui monoclonais e biotina acoplados anticorpos policlonais e recombinante padrão de proteína TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Captura de anticorpos, clone CH8820 </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotina anticorpo de detecção acoplado, o clone AS1 </td></tr><tr><td> TNF proteína alfa </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Recombinante padrão de proteína TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Captura de anticorpos, clone 4H31 </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotina anticorpo de detecção acoplado, o clone MAb11 </td></tr><tr><td> TNF proteína alfa </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Recombinante padrão de proteína TNF-α </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal para o TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Captura de anticorpos, clonar 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticorpo policlonal para o TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Coelho policlonal anticorpo de detecção </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Ficoeritrina </td><td> Musgo </td><td> SAPE-001 </td><td> O reagente de repórter fluorescente para Luminex Assay xMAP </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software Xponent </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPiX Xponent- </td><td> Instrumento Luminex </td></tr><tr><td> Anticorpo xMAP Coupling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Inclui EDC reagente, Sulfo-NHS reagente, tampão de activação, o tampão de lavagem, 1,5 mL tubos de reacção, e pipetas descartáveis </td></tr><tr><td> MagPlex Microesferas, baixa concentração </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Baixos grânulos de concentração (@ 2,5 x 10 6 grânulo / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21.335 </td><td> Kit Biotinilação para detecção de anticorpos não modificada </td></tr><tr><td> Tecan Infinito F200 Leitor </td><td> Tecan </td><td></td><td> Leitor de placas ELISA </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% de PBS-BSA, Tampão de Ensaio </td></tr><tr><td> Uma Pint-Cleaner Compact Ultrasonic, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> Produzir uma freqüência de operação efetiva de 55 kHz </td></tr><tr><td> Separador Tubo Magnético </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288-01 </td><td> Para a separação único tubo 1,5 ml magnética em passos de lavagem de acoplamento </td></tr><tr><td> Separador de placa magnética </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Para a separação de 96 poços da placa magnética em passos de lavagem de ensaio </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido a principal ferramenta para a detecção de analitos de interesse em amostras biológicas, tanto para pesquisas de ciências humanas e diagnósticos clínicos. Contudo, Elisa tem limitações. É tipicamente realizada em uma microplaca de 96 poços, e os poços são revestidos com anticorpo de captura, exigindo uma quantidade relativamente grande de amostra para capturar um antigénio de interesse. A grande área de superfície dos poços ea ligação hidrofóbica de anticorpo de captura pode também conduzir a não-específica ligação de fundo e aumentada. Além disso, a maioria dos ELISAs dependem mediada por enzima de amplificação de sinal, a fim de alcançar a sensibilidade razoável. Tal amplificação não é sempre linear e pode distorcer resultados assim. Nos últimos 15 anos, uma nova tecnologia surgiu, que oferece os benefícios do ELISA, mas também permite um maior rendimento, maior flexibilidade, volume da amostra reduzida, e menor custo, com um wo semelhanterkflow 1, 2. Luminex xMAP A tecnologia é uma plataforma de micro-array (pérola), permitindo tanto monoplex e ensaios multiplex que podem ser aplicadas tanto para proteína e aplicações de ácido nucléico 3-5. Os grânulos têm o anticorpo de captura covalentemente imobilizada sobre uma área de superfície menor, exigindo menos anticorpo de captura e um menor volume de amostra, em comparação com ELISA, e ligação não específica é significativamente reduzida. Volumes menores de amostra são importantes quando se trabalha com amostras limitantes, como líquor, líquido sinovial, etc 6. Multiplexação o ensaio reduz ainda mais os requisitos de volume de amostra, permitindo vários resultados de uma única amostra. Recentes melhorias por Luminex incluem: o sistema de MAGPIX novo, uma menor, menos caro, analisador mais fácil de usar; de baixa concentração Magnética MagPlex Microesferas que eliminam a necessidade de dispendiosos placas de filtro e vêm em uma concentração de trabalho mais adequado para o desenvolvimento de ensaios ede baixo rendimento aplicações; eo anticorpo xMAP Acoplamento Kit (ABC), que inclui um protocolo, os reagentes e produtos de consumo necessários para o acoplamento pérolas para o anticorpo de captura de interesse. (Veja a seção Materiais para uma lista detalhada do conteúdo do kit.) Nesta experiência, nós converter um pré-optimizado ensaio ELISA para TNF-alfa citocina para a plataforma xMAP e comparar o desempenho dos dois métodos 7-11. TNF-alfa é um biomarcador utilizado na medição das respostas inflamatórias em pacientes com doenças auto-imunes. Começamos por acoplamento quatro anticorpos de captura candidatos para quatro conjuntos de microesferas ou regiões diferentes. Quando misturado em conjunto, estes quatro conjuntos permitir o teste simultâneo de todos os quatro candidatos com quatro anticorpos de detecção separado para determinar a melhor par de anticorpos, os reagentes de poupança, amostra e do tempo. Dois ensaios xMAP são então construído com os dois pares de anticorpos mais óptimas e seu desempenho écomparada com a do ensaio de ELISA original em relação à intensidade do sinal, a gama dinâmica, e sensibilidade.

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Um ELISA pode ser facilmente convertido para um ensaio de xMAP Luminex e, através dos benefícios da multiplexação, vários anticorpos podem ser rastreados simultaneamente para identificar um par de anticorpos óptima, resultando em aumento da sensibilidade e gama dinâmica, enquanto reduz o custo do ensaio.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

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