Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
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Este trabajo fue financiado por Luminex Corporation.

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	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Este trabajo fue realizado a Luminex Corporation con equipos fabricados en el Luminex Corporation. R &amp; D Systems y EMD Millipore son socios estratégicos de Luminex Corporation, con licencia para desarrollar y comercializar los ensayos multiplex xMAP base.

La conversión de un ensayo ELISA para la plataforma Luminex xMAP puede ser tan simple como la sustitución de estreptavidina peroxidasa de rábano (SA-HRP) en un típico kit de ELISA con estreptavidina ficoeritrina (SA-PE), y la optimización del rendimiento. Para aquellos que desean crear un inmunoensayo xMAP desde cero, esto se puede lograr con un protocolo sencillo que también permite la evaluación rápida, múltiplex de los pares de anticuerpos. Los reactivos para el ensayo xMAP se prepararon fácilmente con el kit de anticuerpos xMAP de acoplamiento para acoplar los anticuerpos de captura designados para MagPlex baja concentración de microesferas. El uso de microesferas de baja concentración se reduce el coste de desarrollo de ensayos mientras que proporciona el rendimiento del ensayo mismo de mayor concentración de microesferas. La cantidad de tiempo requerido para preparar acoplado MagPlex microesferas es aproximadamente 3 horas, que es mucho más rápido que el 22 - 24 horas requerido para recubrir el pocillo de una placa de ELISA, seguido por el tratamientode los pocillos recubiertos. El rendimiento del ensayo xMAP es también superior a la de ELISA en términos de límite de detección (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / ml) y rango dinámico (&lt;4 pg / ml a&gt; 8000 pg / ml frente a 16 pg / ml a 1000 pg / ml). Lectores de la placa tienen una limitada gama de DO que es 3 o 4 OD, restringiendo el límite superior del rango dinámico para un ensayo. Sin duda, no todos los anticuerpos funcionan en un formato ELISA y no todos los anticuerpos que funcionan bien en un método de ELISA son fácilmente transferibles a el formato de ensayo xMAP. Sin embargo, puesto que los ensayos de xMAP pueden ser multiplexados (es decir, ejecutar simultáneamente), es posible evaluar la captura de varias combinaciones de detección de anticuerpos y simultáneamente para identificar el mejor par de usar para un ensayo. Este proceso ahorra tiempo y reactivos en comparación con el procedimiento de desarrollo de ELISA, que está limitada a la evaluación de un par a la vez. Si dos o más pares de anticuerpos realizar equivalentemente; otros parámetros del ensayo puedeconsiderarse para determinar la idoneidad del par (por ejemplo, disponibilidad, coste, etc.) Además de un rendimiento mejorado y ensayo de flexibilidad con el ensayo xMAP, también hay un ahorro significativo. La cantidad recomendada de anticuerpo necesaria para recubrir un solo pozo de una placa de ELISA es 400ng, mientras que la cantidad necesaria para las perlas utilizadas en un pocillo de un ensayo xMAP es de aproximadamente 7,5 ng. Así, la cantidad de anticuerpo necesaria para un ELISA bien proporcionará más de 50 resultados de la prueba, si se utiliza en un ensayo xMAP. Para aplicaciones que implican muestras preciosas, xMAP también tiene una ventaja significativa. El volumen de muestra recomendado para el ELISA es 100 l, mientras que el volumen requerido para el ensayo xMAP puede ser un medio de que, o menos. En resumen, la conversión de un ensayo de ELISA para la plataforma Luminex xMAP es sencillo, eficiente y ahorro de costes, mientras que la producción de un ensayo con un rango dinámico superior y la sensibilidad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Descripción </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Humanos TNF-α/TNFSF1A DuoSet kit ELISA </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Incluye monoclonales y biotina acoplados anticuerpos policlonales y proteína recombinante estándar de TNF-α </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Captura de anticuerpos, el clon CH8820 </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotina acoplado Detección de anticuerpos, el clon AS1 </td></tr><tr><td> La proteína TNF alfa </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> TNF-α recombinante de proteínas estándar </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> Captura de anticuerpos, el clon 4H31 </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotina acoplado Detección de anticuerpos, el clon MAb11 </td></tr><tr><td> La proteína TNF alfa </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> TNF-α recombinante de proteínas estándar </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal a TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Captura de anticuerpos, clonar 3C7.2 </td></tr><tr><td> Anticuerpos policlonales a TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Detección de anticuerpo de conejo policlonal </td></tr><tr><td> Estreptavidina-ficoeritrina </td><td> Musgo </td><td> SAPE-001 </td><td> Reactivo fluorescente reportero de Luminex xMAP Ensayo </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Software XPONENT </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Aparato Luminex </td></tr><tr><td> xMAP anticuerpos de acoplamiento (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Incluye reactivo de la EDC, el reactivo sulfo-NHS, el tampón de activación, el tampón de lavado, tubos de 1,5 mL de reacción y pipetas desechables </td></tr><tr><td> MagPlex microesferas, la baja concentración </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, ID-MC10013, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Cuentas de baja concentración (2,5 x @ 10 6 bolas / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinilación kit para la detección de anticuerpos sin modificar </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> Lector de placas ELISA </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% de PBS-BSA, Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> Una pinta-limpiador ultrasónico compacto, 115 VCA </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> Produce una frecuencia de operación efectiva de 55 kHz </td></tr><tr><td> Separador de tubo magnético </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288 a 01 </td><td> Para la separación solo tubo 1,5 ml magnético en los pasos de lavado de acoplamiento </td></tr><tr><td> Separador placa magnética </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269-01 </td><td> Para 96-así separación placa magnética en los pasos de lavado de ensayo </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

La prueba de inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) ha sido durante mucho tiempo la principal herramienta para la detección de analitos de interés en las muestras biológicas tanto para la investigación en ciencias biológicas y diagnóstico clínico. Sin embargo, ELISA tiene sus limitaciones. Se realiza típicamente en una microplaca de 96 pocillos, y los pocillos se revisten con anticuerpo de captura, que requiere una cantidad relativamente grande de la muestra para capturar un antígeno de interés. La gran superficie de los pocillos y la unión hidrofóbica de anticuerpo de captura puede también conducir a no específica la unión de fondo y mayor. Además, la mayoría de ELISA depender enzima mediada por la amplificación de la señal con el fin de lograr una sensibilidad razonable. Tal amplificación no siempre es lineal y puede por lo tanto los resultados de inclinación. En los últimos 15 años, una nueva tecnología ha surgido, que ofrece los beneficios de la prueba ELISA, sino que también permite un mayor rendimiento, mayor flexibilidad, reducción del volumen de la muestra, y un menor coste, con un ¡ay similaresrkflow 1, 2. Luminex xMAP Technology es una microesfera (bola) plataforma matriz que permite tanto monoplex y ensayos multiplex que se pueden aplicar tanto a la proteína y las aplicaciones de ácido nucleico 3-5. Las perlas tienen el anticuerpo de captura covalentemente inmovilizado sobre una superficie más pequeña, requiriendo menos anticuerpo de captura y pequeños volúmenes de muestra, en comparación con el ELISA, y la unión no específica se reduce significativamente. Pequeños volúmenes de muestra son importantes cuando se trabaja con muestras limitantes como el líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc 6. Multiplexación el ensayo reduce aún más los requisitos de volumen de la muestra, lo que permite múltiples resultados de una sola muestra. Las recientes mejoras de Luminex incluyen: el nuevo sistema de MAGPIX, uno más pequeño, menos costoso, más fácil de usar analizador; baja concentración magnética MagPlex microesferas que eliminan la necesidad de costosas placas de filtro y vienen en una concentración de trabajo más adecuado para el desarrollo y ensayobajo rendimiento de aplicaciones, y el anticuerpo xMAP kit de acoplamiento (ABC), que incluye un protocolo, reactivos y consumibles necesarios para el acoplamiento de cuentas para el anticuerpo de captura de interés. (Vea la sección de Materiales para obtener una lista detallada del contenido del kit.) En este experimento, convertir un ensayo de pre-optimizado ELISA para TNF-alfa citoquina a la plataforma xMAP y comparar el rendimiento de los dos métodos 7-11. TNF-alfa es un marcador biológico utilizado en la medición de las respuestas inflamatorias en pacientes con trastornos autoinmunes. Comenzamos por el acoplamiento de cuatro anticuerpos de captura candidatos a cuatro conjuntos de microesferas y regiones diferentes. Cuando se mezclan, estos cuatro conjuntos de permitir el análisis simultáneo de todos los cuatro candidatos con cuatro anticuerpos de detección separadas para determinar el mejor par de anticuerpos, reactivos de ahorro, la muestra y el tiempo. Dos ensayos xMAP luego se construye con los dos pares de anticuerpos más óptimos y es su rendimientoen comparación con la del original ensayo ELISA en cuanto a intensidad de la señal, el rango dinámico, y la sensibilidad.

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Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Un ELISA se puede convertir fácilmente a un ensayo de Luminex xMAP y, a través de los beneficios de anticuerpos de multiplexación, varios pueden ser examinados simultáneamente para identificar un par de anticuerpos óptima, dando lugar a una mayor sensibilidad y rango dinámico, mientras que reduce el coste del ensayo.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

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