Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Luminex Corporation.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Detta arbete utfördes vid Luminex Corporation med utrustning tillverkas vid Luminex Corporation. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore är strategiska partners till Luminex Corporation; tillstånd att utveckla och kommersialisera multiplex xMAP baserade analyser.

Omvandlingen av en ELISA-analys till Luminex xMAP plattform kan vara så enkelt som att ersätta streptavidin pepparrotsperoxidas (SA-HRP) i en typisk ELISA kit med streptavidin fykoerytrin (SA-PE), och optimera för prestanda. För dem som vill skapa en xMAP immunanalys från grunden, kan detta ske med ett enkelt protokoll som även möjliggör snabb, multiplex utvärdering av antikroppar par. Reagenserna för xMAP analysen var lätt framställas med användning av xMAP Antikropp Koppling kit för att koppla de utsedda infångningsantikroppar att MagPlex låg koncentration mikrosfärer. Användningen av låga koncentrationen mikrosfärer minskar kostnaderna för analysen utveckling samtidigt ger samma analys prestanda högre koncentration mikrosfärer. Den tid som krävs för att framställa kopplad MagPlex mikrosfärer är cirka 3 timmar, vilket är mycket snabbare än den 22 - 24 timmar som krävs för att belägga brunnen i en ELISA-platta, följt av behandlingav de belagda brunnarna. Utförandet av xMAP analysen är också överlägsen den ELISA med avseende på detektionsgränsen (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / ml) och dynamiskt område (&lt;4 pg / ml till&gt; 8000 pg / ml vs 16 pg / ml till 1000 pg / ml). Plattan läsare har en begränsad OD intervall som är antingen 3 eller 4 OD, begränsar den övre gränsen för det dynamiska området för en analys. Utan tvekan kommer inte alla antikroppar arbeta i en ELISA-format och att inte alla antikroppar som fungerar bra i ett ELISA är lätt att överföra till den xMAP analysformat. Eftersom xMAP analyser kan multiplexeras (dvs, köras samtidigt), är det möjligt att utvärdera ett flertal avskiljning och upptäckt kombinationer antikroppar samtidigt för att identifiera det bästa paret att använda för en analys. Denna process sparar mycket tid och reagenser jämfört med ELISA-utvecklingen förfarandet, som är begränsad till utvärderingen av ett par i taget. Om två eller flera antikroppar par utföra likvärdigt, andra parametrar i analysen kananses att bestämma lämpligheten av paret (t.ex., tillgänglighet, kostnad, etc). Förutom förbättrad analys prestanda och flexibilitet med xMAP analysen finns det också betydande kostnadsbesparingar. Den rekommenderade mängden antikropp som krävs för att belägga en enda brunn i en ELISA-platta är 400 ng, medan den mängd som krävs för pärlorna som används i en brunn av en xMAP analys är approximativt 7,5 ng. Sålunda kan mängden antikroppar som krävs för en ELISA-brunn kommer att ge mer än 50 testresultaten, om den används i en xMAP analys. För tillämpningar med dyrbara prover har xMAP också en betydande fördel. Provmängden som rekommenderas för ELISA är 100 | il medan den volym som krävs för xMAP analysen kan vara hälften av eller mindre. Sammanfattningsvis är omvandling av en ELISA-analys till Luminex xMAP plattformen okomplicerad, effektiva och kostnadsbesparande, samtidigt som det producerar en analys med överlägsen dynamik och känslighet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Beskrivning </td><td> Leverantör </td><td> Katalognr </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA-kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Innefattar monoklonala och biotin kopplat polyklonala antikroppar och rekombinant TNF-α proteinstandard </td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp mot TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Infångningsantikropp, klon CH8820 </td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp mot TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin kopplad detektionsantikropp, klon AS1 </td></tr><tr><td> TNF-alfa-protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinant TNF-α proteinstandard </td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp mot TNF-α </td><td> Novus </td><td> NBP1-50.115 </td><td> Infångningsantikropp, klon 4H31 </td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp mot TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78.162 </td><td> Biotin kopplat detektionsantikropp, klon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF-alfa-protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18.460 </td><td> Rekombinant TNF-α proteinstandard </td></tr><tr><td> Monoklonal antikropp mot TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Infångningsantikropp, klona 3C7.2 </td></tr><tr><td> Polyklonal antikropp mot TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654.250 </td><td> Kanin polyklonal detektionsantikropp </td></tr><tr><td> Streptavidin-fykoerytrin </td><td> Mossa </td><td> SAPE-001 </td><td> Fluorescerande reporter reagens för Luminex xMAP Analys </td></tr><tr><td> MAGPIX vikt / xPONENT programvara </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Luminex instrumentet </td></tr><tr><td> xMAP Antikropp Koppling (ABC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Inkluderar EDC reagens, Sulfo-NHS-reagens, aktivering buffert, tvättbuffert, 1,5 ml rör reaktion och engångspipetter </td></tr><tr><td> MagPlex Mikrosfärer, låg koncentration </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Låg koncentration pärlor (@ 2,5 x 10 6 pärl / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21.335 </td><td> Biotinyleringskit för icke-modifierad detektionsantikropp </td></tr><tr><td> Tecan Oändlig F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> ELISA-plattläsare </td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad saltlösning </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Analysbuffert </td></tr><tr><td> En Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> Producera en effektiv arbetsfrekvens på 55 kHz </td></tr><tr><td> Magnetisk Rör Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288 till 01 </td><td> För enstaka 1,5 ml rör magnetisk separation i kopplings tvättsteg </td></tr><tr><td> Magnetplattan Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269 till 01 </td><td> För 96-brunnsplatta magnetisk separation i steg assay tvätt </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Den immunadsorberande analys (ELISA) har länge varit det viktigaste verktyget för detektering av analyter av intresse i biologiska prover för både biovetenskaplig forskning och klinisk diagnostik. Har dock ELISA begränsningar. Det utförs typiskt i en 96-brunnars mikroplatta, och brunnarna belagda med infångande antikropp, vilket kräver en relativt stor mängd prov för att fånga en antigen av intresse. Den stora ytan av brunnarna och den hydrofoba bindningen av infångande antikropp kan också leda till icke-specifik bindning och ökad bakgrund. Dessutom har de flesta ELISA förlita sig på enzym-förmedlad förstärkning av signalen i syfte att uppnå rimlig känslighet. Sådan förstärkning är inte alltid linjärt och kan därmed skeva resultat. Under de senaste 15 åren har en ny teknik fram som erbjuder fördelarna med ELISA, men också möjliggör högre genomströmning, ökad flexibilitet, minskad provvolym, och lägre kostnad, med en liknande workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology är en mikrosfär (pärla) array plattformen möjliggör både monoplex och analyser multiplex som kan tillämpas på både protein och nukleinsyra program syra 3-5. Pärlorna har den infångande antikroppen kovalent immobiliserad på en mindre yta, som kräver mindre infångningsantikropp och mindre volymer prov, jämfört med ELISA-, och icke-specifik bindning är signifikant minskad. Mindre provvolymer är viktiga när man arbetar med att begränsa prover, såsom cerebrospinalvätska, ledvätska, etc. 6. Multiplexering analysen ytterligare minskar kraven provvolym, vilket gör flera resultat från ett enda prov. De senaste förbättringarna av Luminex är: det nya MAGPIX, ett mindre, billigare, lättare att använda analysator, låg koncentration Magnetic MagPlex Mikrosfärer som eliminerar behovet av dyra filter plattor och finns i en fungerande koncentration bättre lämpad för analys utveckling ochlåg genomströmning tillämpningar, och xMAP antikropp Coupling (ABC) Kit, som innehåller ett protokoll, reagens och förbrukningsvaror som behövs för koppling pärlor till infångningsantikroppen av intresse. (Se Material avsnitt för en detaljerad lista över kit innehåll.) I detta experiment omvandla vi en pre-optimerad ELISA-analys för TNF-alfa cytokin till xMAP plattformen och jämföra resultatet av de två metoderna 7-11. TNF-alfa är en biomarkör för mätning av inflammatoriska responser i patienter med autoimmuna sjukdomar. Vi börjar med att koppla fyra antikroppar kandidat fånga till fyra olika mikrosfär uppsättningar eller regioner. När de blandas ihop dessa fyra uppsättningar möjliggöra samtidig testning av alla fyra kandidater med fyra separata detektionsantikroppar att bestämma den bästa antikroppen paret, spara reagenser, prov och tid. Två xMAP analyser sedan konstrueras med de två mest optimala antikroppspar och deras prestanda ärjämfört med den för den ursprungliga ELISA-analys i avseende på signalstyrka, dynamiskt område och känslighet.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

En ELISA kan lätt omvandlas till en Luminex xMAP-analys och genom fördelarna med multiplexering, flera antikroppar kan screenas samtidigt för att identifiera en optimal antikroppspar, vilket resulterar i ökad känslighet och dynamiska område, samtidigt som den minskar analys kostnad.

Konvertering av en ELISA för att en Luminex xMAP analys med hjälp av en Multiplex metod Antibody Screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Capture Microdissection av däggdjur

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Cell ta med en mikroflödessystem enhet

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-nukleär antikropp Screening med hjälp av HEp-2-celler

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

En metod för att välja Struktur-växling Aptamerer Tillämpat på en kolorimetrisk Gold nanopartiklar analys

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...