Name: conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Bu çalışma Luminex Corporation tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system.">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li><li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay.">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li><li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis.">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61 (2006).</li><li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex.">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li><li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis.">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li><li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies.">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li><li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles;+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro.">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li><li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA:+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants.">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li><li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits.">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li><li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23.">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li></ol>

Bu çalışma Luminex Corporation üretilen ekipmanlar ile Luminex Corporation yapıldı. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore Luminex Corporation&#39;ın stratejik ortakları olan; multipleks xMAP dayalı testler geliştirmek ve ticarileştirmek için lisanslı.

Luminex xMAP platformuna bir ELISA testinin dönüşüm streptavidin fikoeritrin (SA-PE) ile tipik bir ELISA kiti streptavidin horseradish peroksidaz (SA-HRP) yerine, ve performans için optimize kadar basit olabilir. Kadar yerden bir xMAP immunoassay yaratmak isteyenler için, bu da antikor çiftlerinin hızlı, multipleks değerlendirilmesini sağlar basit bir protokol ile gerçekleştirilebilir. XMAP tayini için reaktifler kolayca çift belirlenmiş yakalama antikorlar MagPlex düşük konsantrasyonda mikrosferler ile xMAP Antikor Kuplaj kiti kullanılarak hazırlandı. Düşük konsantrasyonda mikrosferler kullanımı daha yüksek konsantrasyonda mikrosferler ile aynı test performansı sağlarken assay gelişme maliyetini düşürür. Birleştiğinde MagPlex mikrosferler hazırlamak için gerekli zaman miktarı olan 22 daha hızlıdır, yaklaşık 3 saat - 24 saat tedavi ardından, mont, bir ELISA plaka iyi için gereklikaplamalı kuyuların. XMAP testinin performanslı bir algılama (&lt;4 pg / mL vs&gt; 31 pg / mL) ve dinamik aralık (&lt;4 pg / ml&gt; 8000 pg / mL vs 16 sınırı açısından da ELISA üstündür pg / ml 1000 pg / ml). Plaka okuyucuların bir deney için dinamik aralığı üst sınırını kısıtlayarak, ya 3 ya da 4 OD sınırlı bir OD yelpazesi var. Kuşkusuz, tüm antikorların ELISA biçimde çalışır ve bir ELISA iyi çalışmamaktadır tüm antikorlar xMAP tahlil formata kolayca aktarılabilir. XMAP testler (aynı anda çalışabilir, yani) çoğaltılmış olabilir beri Ancak, bir deney için kullanılacak en iyi çifti belirlemek için aynı anda birden fazla yakalama ve algılama antikor kombinasyonları değerlendirmek mümkündür. Bu süreç, önemli zaman ve her seferinde bir çiftin değerlendirilmesi ile sınırlıdır ELISA geliştirme prosedürü göre reaktifleri kaydeder. Iki veya daha fazla antikor çiftleri eşdeğer yapmalıdır; testin diğer parametreleri olabilirçift ​​(örneğin, kullanılabilirlik, maliyet, vb) uygunluğunu belirlemek için düşünülebilir. XMAP tayini ile geliştirilmiş test performans ve esnekliğe ek olarak, önemli maliyet tasarrufları da vardır. Bir xMAP assay of iyi bir kullanılan boncuklar için gerekli miktarı yaklaşık 7.5 ng iken antikor tavsiye edilen miktarı, tek bir kat ve bir ELISA plaka 400ng olduğu için gereklidir. Böylece, bir ELISA için gerekli olan antikor miktarını iyi bir xMAP deneyde kullanılır ise, 50 den fazla test sonuçları sağlayacaktır. Değerli örnekleri içeren uygulamalar için, xMAP ayrıca önemli bir avantajı vardır. XMAP tahlil için gerekli hacminin yarısı veya daha az olabilir, oysa ELISA için önerilen örnek hacmi 100 uL olduğunu. Üstün dinamik aralık ve duyarlılık ile test üretirken Özetle, Luminex xMAP platformuna bir ELISA testinin dönüştürme, komplikasyonsuz verimli ve maliyet tasarrufu sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Tanım </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kiti </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Monoklonal ve biyotin birleştiğinde poliklonal antikorlar ve rekombinant TNF-α standart protein içerir </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> , Klon CH8820 Antikor Capture </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin coupled Algılama Antikor, klon AS1 </td></tr><tr><td> TNF alfa protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinant TNF-α protein standart </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> , Klon 4H31 Antikor Capture </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> Novus </td><td> NB100-78.162 </td><td> Biotin coupled Algılama Antikor, klon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF alfa protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Rekombinant TNF-α protein standart </td></tr><tr><td> TNF-α, monoklonal antikor </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Antikor Capture, 3C7.2 clone </td></tr><tr><td> TNF-α için poliklonal antikor </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Tavşan poliklonal Algılama Antikor </td></tr><tr><td> Streptavidin-Fikoeritrin </td><td> Yosun </td><td> SAPE-001 </td><td> Luminex xMAP Assay için Floresan muhabiri reaktif </td></tr><tr><td> MAGPIX w / xPONENT Yazılım </td><td> Luminex Şirketi </td><td> MAGPIX-XPONENT </td><td> Luminex Enstrüman </td></tr><tr><td> xMAP Antikor Kaplin (AbC) Kit </td><td> Luminex Şirketi </td><td> 40-50016 </td><td> EDC reaktifi, sülfo-NHS reaktifi aktivasyon tampon, yıkama tamponu, 1.5 ml reaksiyon tüpleri ve tek kullanımlık pipetler içerir </td></tr><tr><td> MagPlex mikroküreleri Düşük Konsantrasyon </td><td> Luminex Şirketi </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Düşük konsantrasyon boncuklar (@ 2.5 x 10 6 boncuk / mL) </td></tr><tr><td> EZ-Link sülfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Değiştirilmemiş algılama antikor biyotinilasyon kiti </td></tr><tr><td> Tecan Sonsuz F200 Okuyucu </td><td> Tecan </td><td></td><td> ELISA plaka okuyucu </td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> % 1 BSA-PBS, Tayin tamponu </td></tr><tr><td> Bir Pint Kompakt Ultrasonik Temizleyici, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08.849-00 </td><td> 55 kHz etkili bir çalışma frekansı üretin </td></tr><tr><td> Manyetik Boru Ayırıcı </td><td> Luminex Şirketi </td><td> CN-0288-01 </td><td> Kaplin yıkama adımları tek 1.5mL tüp manyetik ayırma için </td></tr><tr><td> Manyetik Kalıp Ayırıcı </td><td> Luminex Şirketi </td><td> CN-0269-01 </td><td> Tahlil yıkama adımda 96-plaka manyetik ayırma için </td></tr></tbody></table>

conversion of a capture elisa to a luminex xmap assay using a multiplex antibody screening method

Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) uzun yaşam bilim araştırma ve klinik teşhis hem de biyolojik örnekler ilgi analitlerin tespiti için temel araç olmuştur. Bununla birlikte, ELISA sınırlamaları vardır. Bu, tipik olarak bir 96-kuyucuklu mikroplaka gerçekleştirilir ve kuyuları, ilgilenilen bir antijen yakalamak için örnek nispeten büyük bir miktarda gerektiren, yakalama antikoru ile kaplanır. Kuyularının geniş yüzey alanına ve antikor çekimi hidrofobik bağlayıcı da spesifik olmayan bağlama ve yüksek arka yol açabilir. Ayrıca, çoğu ELISA&#39;lar makul bir hassasiyeti elde etmek için sinyallerin enzim-aracılı amplifikasyon dayanır. Böyle amplifikasyon her zaman doğrusal değildir ve can böylece çarpık sonuçlar. Geçen 15 yıl içinde, yeni bir teknoloji benzer bir wo ile, bu ELISA faydalar sunar, aynı zamanda daha yüksek verim, yüksek esneklik, azaltılmış örnek hacmi ve düşük maliyet sağlayan ortaya çıkmıştırrkflow 1, 2. Luminex xMAP Teknoloji monoplex protein ve nükleik asit uygulamalarının 3-5 hem uygulanabilir multipleks testler ile birlikte etkin bir mikroküre (boncuk) dizi platformudur. Boncuklar ELISA ile karşılaştırıldığında, daha az ve daha küçük antikor çekimi Örnek miktarlara, kovalent olarak daha küçük bir yüzey alanı üzerine sabitlenmiş yakalama antikoru sahiptir, ve spesifik olmayan bağlanma önemli ölçüde azalır. Gibi beyin omurilik sıvısı, eklem sıvısı, vb 6 gibi sınırlayıcı örnekleri ile çalışırken daha küçük örnek hacmi önemlidir. Tahlil multiplekslemesi daha tek bir örnekten çok sayıda sonuç sağlayarak, örnek hacmi gereksinimlerini azaltır. Luminex tarafından son gelişmeler şunlardır: Yeni MAGPIX sistemi, bir küçük, daha ucuz, kolay kullanımlı analizörü; Düşük Konsantrasyon Manyetik MagPlex Mikroküreler pahalı filtre plakaları olan ihtiyacı ortadan kaldırmak ve daha iyi analiz gelişimi için uygun bir çalışma konsantrasyonu gelir vedüşük hacimli uygulamalar ve xMAP Antikor Kaplin (AbC) Kit, bir protokol, reaktifler ve ilgi yakalama antikor boncuk bağlanması için gerekli sarf malzemeleri içerir. (Kit içeriğini ayrıntılı bir listesi için malzemeler bölümüne bakınız.) Bu deneyde, biz xMAP platformuna TNF-alfa sitokin için bir ön optimize ELISA testi dönüştürmek ve iki yöntem 7-11 performansını karşılaştırmak. TNF-alfa otoimmün hastalığı olan hastalarda inflamatuar yanıtların ölçümünde kullanılan bir biyolojik belirteç olduğunu. Biz dört farklı mikroküre setleri veya bölgelere dört aday yakalama antikorlar kaplin ile başlar. Birlikte karıştırıldığında, bu dört takım iyi antikor çifti, tasarruf reaktifler, örnek ve zamanı belirlemek için dört ayrı algılama antikorlar ile dört adayların aynı anda test için izin verir. İki xMAP testlerin ardından iki en iyi antikor çiftleri ile inşa ve performans edilirsinyal gücü, dinamik aralık ve duyarlılık konusunda özgün ELISA testi kıyasla.

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method at JoVE.com

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Bir ELISA kolayca Luminex xMAP assay dönüştürülebilir ve, çoğullama, çeşitli antikorların avantajları ile tahlil maliyet düşürürken, artan duyarlılık ve dinamik aralığı ile sonuçlanan, optimum bir antikor çifti tanımlamak için eşzamanlı taranabilir.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...