Name: automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans at JoVE.com

Författarna vill tacka A. Benham för att hjälpa med utvecklingen av protokollet. Detta arbete har finansierats av NIH anslag NS06747 till Bab

1. Beredning av Worms för Imaging Detta segment av protokollet är baserad på tillgänglig C. elegans odlingstekniker 1,2, och beskrivs i figur 1. <ol><li> Växer maskar på höga pepton NGM agarplattor (10 cm) med kärnor med NA22 E. coli-bakterier tills nästan svalt. Om immunfärgning kommer en platta ger ett tillförlitligt tillräckligt maskar för 1 person fläcken, med beaktande av förluster längs vägen, och de strikta kriterier som...

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

Metoden som presenteras här är utformad för att extrahera kvantitativa multi-parameterdata för stora populationer av synapser i C. elegans, samtidigt maximera enhetlighet inom behandlingsgrupper. Tre funktioner bidra till dessa mål. Först immunfärgning utförs på synkrona mask populationer för att se till att alla djur är i samma ålder. Detta steg är avgörande eftersom utvecklande reglering av uttryck nivåer kan dölja effekterna av experimentell behandling (t.ex. UNC-49 GABA-receptorn immunofluor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på programmet </td><td> Företaget </td><td></td><td> Kommentarer (valfri) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 eller högre </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> Kontrollera din lokala anläggning Imaging Core tillgång till detta program. Demo mjukvara finns på PerkinElmer hemsida. Denna metod kräver endast Kvantifiering modulen Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 2. Specifika reagens och utrustning. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Ägg-buffert </td><td> NaCl KCl CaCl2- MgCl2- HEPES (Justera pH till 7,3) </td> &lt;TD&gt; 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Alkalisk hypoklorit (för 5 ml) </td><td> Färsk hushållsblekmedel (kasta flaskan 30 dagar efter öppnandet) 10 N NaOH ddHaO 2 O </td><td> 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. Solutions. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

Synapse styrka hänvisar till amplituden postsynaptiska svar presynaptiska evenemang neurotransmitterfrisättning, och har en stor inverkan på den totala neural krets funktion. Synapse styrka beror till stor del på det överflöd av neurotransmittorreceptorer klustrade på synaptiska ställen på postsynaptiska membranet. Receptor nivåer är etablerade utvecklingsmässigt och kan ändras genom receptor trafficking mellan yt-lokaliserad, subsynaptic och intracellulär pooler, som representerar viktiga mekanismer för synaptisk plasticitet och neuromodulering. Rigorösa metoder för att kvantifiera synaptiskt-lokal överflöd signalsubstansen receptor är viktigt att studera synaptisk utveckling och plasticitet. Fluorescensmikroskopi är en optimal lösning, då den bevarar rumslig information, och skilja synaptisk från icke-synaptiska pooler och diskriminering bland receptorpopulationer lokaliserade till olika typer av synapser. Den genetiska modellorganism Caenorhabditis elegans är särskilt väl lämpad för dessa studier på grund av den ringa storleken och den relativa enkelheten i dess nervsystemet, dess transparens, och tillgängligheten av kraftfulla genetiska tekniker, medger undersökning av nativa synapser i intakta djur. Här presenterar vi en metod för att kvantifiera fluorescensmärkta synaptiska neurotransmittor-receptorer i C. elegans. Dess viktigaste funktion är automatiserad identifiering och analys av enskilda synapser i tre dimensioner i flera plan konfokala filer mikroskop produktionen, tabulering ställning, volym, fluorescens intensitet och total fluorescens för varje synaps. Detta tillvägagångssätt har två huvudsakliga fördelar jämfört manuell analys av z-plana projektioner av konfokala data. Först, eftersom varje plan konfokala datamängden ingår, inga data som förloras genom z-planet projektion, vanligtvis baserat på pixelintensiteten genomsnitt eller maxima. Andra, identifiering av synapser är automatiserad, men kan inspekteras av frittperimenter som dataanalysen fortskrider, vilket tillåter snabb och exakt extraktion av data från ett stort antal synapser. Hundratals till tusentals synapser per prov kan lätt erhållas, som producerar stora datamängder för att maximera statistisk styrka. Överväganden för beredning C. elegans för analys, och utför konfokal avbildning för att minimera variabiliteten mellan djur inom behandlingsgrupperna diskuteras också. Även utvecklades för att analysera C. elegans postsynaptiska receptorer, är denna metod i allmänhet är användbara för alla typer av synaptiskt-lokaliserad protein, eller faktiskt varje fluorescenssignalen som är lokaliserat till diskreta kluster, puncta eller organeller. Ingreppet görs i tre steg: 1) beredning av prover, 2) konfokal avbildning, och 3) bildanalys. Steg 1 och 2 är specifika för C. elegans, medan steg 3 är i allmänhet tillämpliga på alla punktformig fluorescenssignal i konfokala mikrografer.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans at JoVE.com

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Förekomsten av neurotransmittorreceptorer klustrade vid synapser påverkar starkt synaptisk styrka. Denna metod kvantifierar fluorescensmärkta neurotransmittorreceptorer i tre dimensioner med enkel-synaps upplösning i<em&gt; C. elegans</em&gt;, Vilket gör att hundratals synapser att snabbt präglas i ett enda prov utan störningar införs genom z-planet projektion.

Automatiserad Kvantifiering av synaptisk Fluorescens i<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Testmetoder för β-amyloid toxicitet med hjälp av en transgen C. elegans Modell

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion och exocytos av membranproteiner i odlade nervceller utvärderas med hjälp av fluorescens återhämtning och fluorescens-förlust fotoblekning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Övervakning av förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen och synaptisk effekt i Blötdjur<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking och Behavioral mätning

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylär Avläsning av långsiktigt Olfactory anpassning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-inbäddade immunoguld Märkning av Synaptic proteiner i hippocampus slice kulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualisering neuroblast cytokines Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo avbildning av Dauer specifika Neuronal Remodeling i C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...