Name: expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection
Uploaded: 2012-10-06T14:00:00
Duration: 19 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Эта работа была поддержана Центром по регенеративной терапии, медицинский факультет ТУ Дрездена, и DFG совместных научно-исследовательский центр SFB655 (подпроект A20). BA была поддержана общение DIGS-BB программы, Дрезден. Мы благодарим доктора. Норико Osumi, Tadashi Nomura, Дитер Chichung Ли, и Рави Jagasia за ценные советы при создании внутриутробно электропорации и стереотаксической вирусные инъекции.

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

BA и ФК подали заявку на патент описывающий условные расширение клеток взрослого соматические стволовые cdk4/cyclinD1 вирусы (EP 10160288,6).

Важным шагом для электропорации в внутриутробно является качество и чистоту ДНК, так как его направленности миграции во время родов электрического поля зависит от его заряда. Протоколы для очистки ДНК, которые не включают в себя удаление дополнительных заряженных молекул, таких как эндотоксины, может привести к маскировке природной ДНК отрицательных зарядов приводит к доставке бедных. Очевидно, касаясь стен матки с электродами как можно ближе к области, чтобы быть нацелены улучшить электропорации эффективности. Не менее важным является качество используемых электродов, так как это является основой для предоставления оптимального электрического поля. Микро-царапины не видно на глаз и / или органических остатков, таких как следы сыворотки, липидов и т. д., неизбежно накапливаются с течением времени приводит к потере электродами своих свойств. Старые и / или грязные electropes являются наиболее вероятной причиной резкого падения электропорации эффективность и, таким образом, должно быть тeplaced, как только это заметили. В то время как относительно простые, в электропорации внутриутробно обычно требуется несколько недель тренировок, чтобы достичь удовлетворительного и воспроизводимые результаты. Этот метод очень универсален, поскольку она может быть применена практически к любому органов и тканей развивающегося эмбриона. Конечно, содержащий органов полости, таких как головной мозг, особенно легко на цель и обеспечить высокую долю трансфицированных клеток из-за легкости потребителей инъекционных относительно большой объем ДНК. Общей проблемой столкнулись в создании стереотаксической вирусных инъекций иметь несколько зараженных клеток и / или целевой нежелательных местах. Первая проблема в основном связана с введением низким титром вируса. 293T клетки с меньшим числом проходов в культуре растут быстрее и привести к повышению титров вируса. Использование клеток старше ок. 20 проходов не рекомендуется и средства трансфекции с менее чем 80% эффективности не обеспечит хорошеевирусной производства. Ресуспендирование вирусных гранул также имеет важное значение, вирусной суспензии должен появиться однородной и вирусных сгустки, которые могут закупоривать капиллярной следует избегать. Вирусы очень чувствительны к перепадам температуры и длительного хранения. По этим причинам, аликвоты должны быть постоянно хранится при температуре -80 ° C и не может быть замораживать. Даже в этих условиях, снижение инфекционной можно было наблюдать через 6-12 месяцев хранения. В учебной фазы, мы рекомендуем проверить титр вируса каждого вирусного препарата и сделать это еще раз после длительного хранения. Наличие инфицированных клеток в нежелательных областях мозга может зависеть от оптимального позиционирования мыши голову на стереотаксической рамы, которая требует некоторой практики. Кроме того, очень важно, чтобы не повредить поверхность мозга, открывая отверстие в черепе, потому что в противном случае он не будет возможно сбросить от 0 правильно, на поверхности мягкой мозговой оболочки, в результате неточного инъекций. Координатыпри условии, что мы в этом протоколе говорится C57/BL6 6-10 недель женщин, и мы предлагаем их оптимизации для различных деформаций / возрасту / полу. Приобретение этой техники может потребовать больше времени, чем внутриутробно электропорации в связи с чем дольше фазы, необходимой для подготовки вирусов и анализа образцов. Мы настоятельно рекомендуем вирусов используются только после операции мыши и стереотаксической инъекции стали надежным и воспроизводимым. Первым шагом к достижению этой цели является инъекционные клеточной ДНК проникающих красителей, таких как Hoechst 33342, в эвтаназии мыши и анализировать мозг немедленно. В внутриутробно электропорации и стереотаксической инъекции вирусных два мощных систем остро и тканей специально манипулировать экспрессии генов в ЦНС млекопитающих во время развития и зрелости. Несмотря на свою ограниченность в таргетингом только на субпопуляции клеток, эти системы обеспечивают беспрецедентную скорость и простота по сравнению с более традиционными методами, яN частности трудоемкая и отнимает много времени поколение трансгенных мышей. Однако, несмотря на это сходство, некоторые различия существуют между этими двумя методами, которые стоит упомянуть. Во-первых, в связи с нападкам на различные типы клеток, в электропорации внутриутробно первоначально приводит к трансфекции стволовых клеток собственного (также называемые радиальные глии), потому что только эти клетки разграничения желудочка, где ДНК вводят. В результате деления клеток, плазмиды будет впоследствии унаследовала от целевых, материнские клетки стволовые своих предшественников и / или нервных клеток дочь, ведущих к перераспределению трансфицированных клеток по всему коры как функция времени. В противоположность этому, использование лентивирусов ВИЧ-инфекции во взрослом мозге приводит к одновременному заражения других типов клеток, включая стволовые клетки, предшественники, нейроны, а также глиальные клетки зрелой. Следует отметить, что в связи с использованием лентивирусов ВИЧ, в отличие от наиболее часто используемых ретровирусов является тот факт,лентивирусов, что интеграция будет происходить независимо от митотического состояния клеток, что позволяет адресности и взрослых, спокойных стволовых клеток. Во-вторых, еще одно важное различие между электропорации и вирусные инфекции является то, что преходящее, эписомные выражении достигается за счет бывших в отличие от необратимой интеграции ДНК в геном инфицированной клетки достигается последнего. В результате последовательных клеточных делений, разведение электропорации плазмиды, и деградация внематочной cyclinD1 белка, будет вытекать в каждом клеточном цикле. Таким образом, расширение НСК во время эмбрионального развития был показан лишь в течение примерно двух дней 15 в то время как мозг взрослого человека этот эффект оказался длится в течение нескольких месяцев (неопубликованные результаты). В-третьих, поскольку я) cdk4/cyclinD1 имеет более сильный эффект на клетки с большей G1 и б) совершенные нейронных предшественников во время разработки имеют более клеточного циклачем стволовые клетки, в то время как противоположное справедливо во взрослом возрасте, наши две манипуляции были найдены, чтобы вызвать расширение, в первую очередь, нейронных предшественников во время разработки и стволовых клеток во взрослом возрасте. В любом случае рост нейронов была достигнута обоими методами. В-четвертых, вирусные инъекции могут быть легко выполнены, надежно и воспроизводимо, в различных регионах мозга взрослого человека, просто изменив стереотаксических координат. В отличие от точного нацеливания некоторых регионах центральной нервной системы, такие как ствол головного мозга, гиппокампа, или спинного мозга, в в электропорации внутриутробно может быть более трудно достичь воспроизводимо. Кроме того, в то время как стереотаксической инъекции могут быть выполнены на мышах любого возраста, оптимальной производительности в электропорации внутриутробно ограничен примерно от E11 до E16. Этапы до E11 потребуется либо использование микроскопа ультразвукового обратного рассеяния 18,19 или целый культ эмбрионаЮр системы 17,20. В последнее время возрастает интерес к фундаментальной биологии клетки соматические стволовые клетки был повышен, потому что их исследования и манипуляции, как считается фундаментальным к разработке новой клеточной восстановительной терапии. В частности, для сверхэкспрессии cdk4/cyclinD1, наш протокол предоставляет средства для transitorily увеличить расширение НСК в естественных условиях (рис. 3В и С и 4В и C), с тем чтобы увеличить число нейронов генерируется во взрослом мозге. Мы считаем, что эти манипуляции могут иметь важное значение в ряде различных контекстов, чтобы лучше понять роль НБК в развитии мозга, развитие и гомеостаза, а также их вклад в когнитивные функции или восстановление нейронной дегенерации или травмы.

<table border="1"><tbody><tr><td> Материал / оборудование </td><td> Поставщик </td><td> Каталог # </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree макси плазмиды комплект </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Сигма </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / коричневый пипетки съемника </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Боросиликатное капилляров с нитью </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Столешница лабораторных животных анестезии системе </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 стеклянных шариков стерилизатор </td><td> Southpointe хирургические </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris щипцы </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona решения </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pico насоса </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 квадратных волна электропоратора </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Круглые электроды пинцет </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Шовный материал </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> Рефлексклип объект применения для закрытия раны </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic инъекционного раствора </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM ж / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Плод Бовин сыворотки </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллин / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Блюдо культуры ткани </td><td> Сокол </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Полиэтиленимин 250 мл </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> н-Масляная кислота, натриевая соль </td><td> Сигма </td><td> B 5887 </td><td></td></tг&gt; <tr><td> Труб, тонкостенных, polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Модель 900 малых инструмент стереотаксической животных </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI пико микроскопом </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 контроллер и Nanoliter2000 инжектор </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Стекло замена 3,5 nanoliter </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR сверла общего применения </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Антител </td><td> Поставщик </td><td> Каталог # </td><td> Разбавление </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Таблица антител. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

<ol><li> В целом, в электропорации внутриутробно дает 60-80% электропорации эмбрионов отображения сильное выражение гена-репортера в широком площадь боковой коры (рис. 3А). Флуоресцентные белки могут быть легко обнаружены на всей эмбрионов крепление, как только 3-6 часа после операции с сигналом продолжительностью более одной недели. В рамках целевой области, около 30-50% клеток обычно выражают трансген (ы) с долей клеток совместно выразить двумя (или более) совместно электропорации трансгенов бытия как правило, выше 90% (рис. 3В, левое) 6,8 , 15. В то время как минимальный уровень апоптоза (около 2.0-2.5%) можно было наблюдать примерно через 2 часа после электропорации, это значение будет вернуться в физиологическом уровнях (около 0.5-1.0%) после 6 часов (FC, неопубликованные данные). Доля эмбрионов или беременных мышей смерти в результате операции, как правило, незначительна (&lt;5%). Co-электропорации с cdk4/cyclinD1 в этих условиях, затем 48 часов развития вызывает увеличение расширения нейронных предшественников на 30% (рис. 3В, справа, и C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Расширение нейронных предшественников по cdk4/cyclinD1 гиперэкспрессия. (A) флуоресценции картина разреза боковой коры эмбрионов мышей через 24 часа после электропорации с GFP и RFP плазмид в эмбриональный день 13. (B) Флуоресцентные фотографии, как и в течение 48 часов после совместного электропорации с cdk4/GFP и cyclinD1/RFP плазмид и иммунного для базисной маркер предшественников Tbr2. Флуоресцентные журналистов с DAPI counterstainig (слева) и Tbr2 (справа) показаны. Линии указывает на апикальной поверхности вентрикулярной зоне (VZ, белые линии) и границы субвентрикулярной зону (СВЗ, желтые пунктирные линии). Обратите внимание на повышенный Тхиckness из SVZ в электропорации часть коры (белые стрелки) за счет увеличения выработки и расширение базального предшественников после того, как избыточная экспрессия cdk4/cyclinD1. (C) Количественный эффект показан на B. Bars = SD, р &lt;0,05, п = 3. Гистограмма в C взята из Lange и соавт., 2009 15. <ol start="2"><li> После вирусной стереотаксической инъекции, ок. 80% оперированных мыши обнаруживают сильную экспрессию трансгенов на протяжении всего зубчатой ​​извилины. Учредительный выражения GFP может быть легко обнаружена на 40 мкм разделы, как только через 4 дня после операции. Наряду ростральной к хвостовой оси зубчатой ​​извилине, около 10-30% клеток (эквивалент в общей сложности ок. 10,000-30,000 клеток) обычно выражают трансген (ы) (рис. 4а) 9. Доля мышей умирают из-за операции незначительна (&lt;5%). Три недели сверхэкспрессия cdk4/cyclinD1 в этих условиях вызывает увеличение НСК более чем на два-складки (рис. 4, б) при уменьшении нейрогенеза на 70% (рис. 4С) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Воздействие вирусной инфекции. (A) 3D реконструкции 7 флуоресценции фотографии взяты из толщиной 40 мкм серийный корональные разделы (сбор 1 раз в 6) по ростральной к хвостовой оси гиппокампа. GFP + инфицированных клеток (зеленый) и DAPI окрашивание ядер (синий) в зубчатой ​​извилине показаны (сверху). Яркие фотографии области корональных разделы, соответствующие показанным на (в центре) и 3D-представление (нижней) части целого полушария с гиппокампе выделены зеленым цветом псевдоцвете (с изменениями от Allen мозга Атлас; <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Белые стрелки указывают в месте инъекции. Боковой (L), ростральной (R), и дорSAL (D) оси (х, у, г стереотаксических координат) указаны (справа). (B и C) Доля нестин + NSC (B) и DCX + новорожденных нейронов (C) в популяции GFP + инфицированных клеток через 3 недели после стереотаксической инъекции GFP (белый) или cdk4/cyclinD1/GFP (черный) вирусов. Бары = SD, р &lt;0,005; п = 3. Графики в B и C взяты из Artegiani и соавт., 2011.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Контроль за расширение соматических стволовых клеток является основным фактором, препятствующим их изучения и использования в терапии. Здесь мы опишем систему управления временно нейронных стволовых клеток расширения во время развития и зрелости, которые могут быть использованы для увеличения числа нейронов генерируются в мозге мыши.

Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем<em&gt; В Utero</em&gt; Электропорации или вирусных Стереотаксическая инъекций

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Роста и дифференцировки взрослых гиппокампа земли Арктики Белка нервные стволовые клетки

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Генерация Тематически трансгенных крыс<em&gt; В утробе матери</em&gt; Электропорацию и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Биолюминесценция Скрининг

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

В Vivo Прямое перепрограммирование резидентных глиальных клеток в интернейроны путем внутримозговой инъекции вирусных векторов

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...