Name: expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection
Uploaded: 2012-10-06T14:00:00
Duration: 19 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Centrum för regenerativ terapi, den medicinska fakulteten i TU Dresden, och DFG Collaborative Research Center SFB655 (delprojekt A20). BA stöddes av en gemenskap av tjuvnyp-BB-programmet, Dresden. Vi tackar Dr. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie och Ravi Jagasia för värdefulla råd under inrättandet av in utero elektroporering och stereotaxisk viral injektion.

Inledande anmärkning Kirurgi måste utföras av helt utbildade forskare vid godkännande från de lokala myndigheterna för djurskyddet. Alla försiktighetsåtgärder skall vidtas för att minimera smärta och stress åsamkas till djur inklusive djup anestesi, administration av postoperativ smärtlindring och för verksamheter som varar mer än 10 minuter, tillämpning av ett öga smörjmedel för att förhindra hornhinnan uttorkning och blindhet. Sövda möss måste hållas konstant varmt vid 37 ° C tills fullständig återhämtning och varje kirurgiska verktyg och lösningen måste vara sterila. Även om användningen av en biologisk huv är inte absolut nödvändigt, måste operatören vidta alla rimliga åtgärder för att minimera risken att infektera djuret under operationen genom att bära en labbrock, mask och handskar. Likaså måste varje steg om generering och användning av virus godkännas och måste utföras i S2 områden enligt föreskrifter från lokala myndigheter.Slutligen måste en grundlig sanering av alla verktyg och ytor som kunde ha varit i kontakt med virus utföras enligt godkänd anläggning desinfektion praxis (för HIV genom att torka med 70% Et-OH och / eller autoklavering). Del 1: Utbyggnad av embryonal NSC 1. In utero elektroporering <ol><li> Efter kloning transgenerna (dvs. cdk4/cyclinD1) i PCM-EGFP (Clontech) eller pDSV-mRFPnls vektorerna 16, rena plasmider med användning EndoFree kit och återsuspendera i steril PBS till en koncentration av 3-5 ug / ul. Snart före operation, blanda plasmider med 0,05% FastGreen i PBS vid ett slutligt förhållande av ca. 04:04:01 och centrifugera blandningen under 2 min vid 16.000 x g för att avlägsna allt fällningar. </li><li> Fyll DNA blandningen i en tidigare drog borsilikatglas kapillär. Dra parametrar med en P-97 pipett avdragare är: pull: 200; vel: 140, tid: 140. Värme ges av en ramp test och beror på specIFIC massa kapillärer som används. Montera kapillären på munstycket för PicoPump som är nära till i livmodern elektroporering plattform (Figur 1A) och under ett stereomikroskop, böj sin spets och nick det på brytpunkt. </li><li> Sterilisera alla kirurgi verktyg i en torr glaspärla autoklav och djupt söva en gravid mus vid dag 12-15 av dräktigheten med en isofluran förångaren. Placera djuret i ryggläge på en uppvärmning plattform inställd på 37 ° C och fortlöpande isofluran förvaltning genom en noskon. </li><li> Raka huden på buken, desinficera med Betaisodona flera gånger, så småningom torka i mellan med 70% etanol och injicera buprenorfin (utspädd i PBS) subkutant vid 0,1 mg / kg koncentration förebyggande smärtstillande. Med fina saxar, gör en 2 cm längsgående snitt i huden och därefter av den underliggande muskulära väggen för att komma åt bukhålan. Fördela i bukhålan ca. 2ml IUE lösning (D-PBS innehållande 100 U / ml pen / strep) förvärmd vid 37 ° C och hålla lösningen på ett värmeblock. </li><li> Täck musen med sterilt drap innehåller en spricka från vilken uteri kommer att tas bort. Dra tillbaka snitt med en volfram upprullningsdon identifiera livmodern och dra ut håller den med pincett mellan intilliggande embryon (Figur 1B, vänster) och slutligen lägga ner på det sterila drap. Under hela operationen, skölj livmodern med IUE lösning för att återfukta orgeln och kroppen hålrum och förhindra uttorkning av djuret. </li><li> Hantera livmodern försiktigt hålla den mellan tummen och index och vrid ett embryo till dess huvud är synlig och inriktad på operatören. Identifiera telencephalic halvklot och spruta en av dem från dorso-laterala sidan. Release 1-2 pl av DNA-lösningen med användning av fotomkopplaren en PicoPump tills ventrikeln beskrivs av FastGreen (figur 1B, höger). </li><li&gt; Placera anod av elektroderna på injektionsstället och katoden på den kontralaterala sidan (Figur 1C) och leverera 6 pulser av 30 V för 50 ms med 950 ms intervall mellan varje puls med en elektroporator genererar fyrkantiga elektriska fält som drivs genom en fotpedal. Undvik att placera elektroderna nära moderkakan eftersom detta kan orsaka blödning och skada embryot. </li><li> När alla embryon injiceras och elektroporerades, placera livmodern tillbaka in i bukhålan och stänga muskulära väggarna med en sutur sträng suturering var 3-4 mm. Knutarna bör tätt till muskeln, men inte alltför hårt för att medge en liten svullnad i vävnaden. Stäng slutligen den överliggande huden med metallklämmor. Desinficera huden med Betaisodona ta bort musen från isofluran masken och överföra den i ett hus bur när den är helt vaken. Övervaka återvinning av musen tills rörelseapparaten beteende är normalt. </li></ol> 2. Behandling av SamPLE <ol><li> En eller flera dagar efter elektroporering, offra musen, samla embryon och identifiera de riktigt elektro med en fluorescerande stereomikroskop (figur 1D). Dissekera hjärnan på iskall PBS och fäst dem över natten i 4% PFA (paraformaldehyd i fosfatbuffert pH 7,4). Så småningom kan BrdU ges före avlivning enligt olika paradigm för att undersöka cellcykelkinetiken och cellproliferation 3. </li><li> Hjärnorna bearbetas sedan för sektionering och immunfärgning för flera markörer för radiell Glia, basala progenitorer och neuroner (Pax6, nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 etc.) för att utvärdera effekten av de funktionella transgener på riktade NSC och deras avkomma som är identifieras genom uttrycket av sam-elektroporerade reportergen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1.In utero elektroporering. (A) Schematisk representation av en i livmodern elektroporering plattform. (B) Ritningar visar positioneringen av den gravida mus under operationen (höger) och injektion av DNA / FastGreen blandning (blå) i telencephalic hemisfären av en musembryo (vänster). (C) Schema visar placeringen av elektroderna i kontakt med livmoderns väggar med anoden (+) intill injektionsstället (blå). Pilar indikerar migrationen av DNA mot anoden. (D) Bild på en musembryo 24 timmar efter elektroporering med GFP plasmider vid embryonal dag 13. Streckad linje avgränsar den telencephalic halvklotet. Schema i en modifierad från Calegari et al. 2004 17. Del 2: Utbyggnad av Vuxen NSC 1. Produktion av HIV härledda-viruspartiklar <ol><li> Dag 1: platta 5 x 10 6 293T celler på en 10 cmskål med 8 ml D-MEM innehållande 10% av värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 100 U / ml pen / strep (odlingsmedium). Använd 15 rätter för en viral beredning och odling över natten vid 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Dag 2: för varje maträtt, späd i 1 ml ren D-MEM 5 pg av vardera av 3 plasmider kodar för i) VSVG (vesikulärt stomatitvirus typ G) höljeprotein, ii) gag / pol (gruppspecifika antigen / polymeras) , och iii) en polycistronisk konstruktion som uttrycker de funktionella och reporter transgener (dvs. cdk4/cyclinD1/GFP) tidigare klonade i en HIV-baserad överföringsvektor (p6NST90) 9. Blanda denna lösning med 1 ml av D-MEM innehållande 45 | il av polyetylenimin som har lösts i förväg i PBS vid 1 mg / ml stamlösning, och inkubera under 15-30 minuter vid rumstemperatur. Under tiden, ta bort media från cellerna och tillsätt 4 ml per skål av färsk D-MEM innehållande 15% av värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 100 U / ml pen / strep. Tillsätt 2 meterl transfektion blandning och kultur över natten. </li><li> Dag 3: tillsätt 120 pl 500 mM Na-butyrat per maträtt att öka uttrycket av transgener, blanda försiktigt och kultur för 6-8 timmar, varefter ersätter transfektion medium med 5 ml odlingsmedium. </li><li> Dag 4: samla supernatanterna (ca 70 ml totalt), passerar genom ett 0,22 pm filter och överföring i rör 2 polyallomer centrifugrör (35 x 89 mm). Ultracentrifug vid 110.000 xg under 90 minuter vid 4 ° C med användning av en gunga rötor. Kasta bort supernatanten, tillsätt 6 ml PBS till varje rör och inkubera på is under 1 timme. Suspendera pelleten och överföra den i ett polyallomer centrifugrör (14 x 95 mm). Ultracentrifug vid 110.000 xg under 90 minuter vid 4 ° C med användning av en gunga rötor. Kasta bort supernatanten, återsuspendera pelleten i 50 pl PBS, gör 5 | il alikvoter och lagra vid -80 ° C. Virustiter kommer att vara i intervallet 10 8 -10 9 cfu / ml. (Obs! virus är mycket känsliga för temperatur och lagring, AVOid återfrysning, hålla på torris under transport och tina snart före användning.) </li></ol> 2. Stereotaktisk injektion <ol><li> Söva en 6-10 veckor gammal mus med isofluran och placera djuret i liggande läge på en stereotaxisk ram (figur 2A) med hjälp av örat barer och gommen stöd till korrekt fixera huvudet. Djuret hålls varm på en värmedyna inställd på 37 ° C och under konstant isofluran förvaltning. </li><li> Injicera subkutant 100 pl av buprenorfin arbetslösning som förebyggande analgetikum, rakning en rand av hud på huvudet av musen och desinficera enligt 1,4. Med hjälp av en skalpell, gör en ca. 1,5 cm lång längsgående snitt på huvudet huden exponera skallen vid nivån för sagittalis suturen. Dra in huden och försiktigt rengöra benytan med en steril bomullspinne. </li><li> Half-fylla ett glas kapillär (specifikationer i 1,2) med paraffinolja och montera den på injektorn pumpen sätterkapillären tills den andra ringen (Figur 2B). Flytta den kapillära hållaren i x, y och z-axeln tills spetsen av kapillären är placerad på bregma, konjunktionen punkten mellan de sagittala och laterala suturer (Figur 2C) (som skall fastställas med hjälp av ett stereomikroskop), och åter-set x, y och z-värden till 0. </li><li> Flytta kapillären med ± 1,6 mm i medio-laterala axeln (x) och -1,9 mm i den främre-bakre axeln (y) och markera benet med hjälp av en kirurgisk märkpenna. Gör ett hål på ca. 0,5 mm diameter på skallen med hjälp av en elektrisk Driller uppmärksamma att inte skada hjärnan. </li><li> Sätt en 5 pl droppe av virussuspension (1 alikvot) på en bit parafilm placeras på örat barer och immerge spetsen på kapillären i droppen. Suck ca. 3,5 pl virussuspension med en nanoliter injektor satt till 55 nl / sek. Utför detta steg snabbt när droppen förångas. </li><li> Flytta kapillären till platsen of-injektionen och flytta den nedåt tills spetsen vidrör pial ytan. Återställ dorso-ventrala axeln värde (z) till 0. Vid denna punkt, penetrerar vävnaden med kapillären för -1,9 mm och släppa 1,5 il virussuspension med en hastighet av 4 nl / sek. Vänta 2-3 minuter för att minimera återflöde av virussuspension tråg det kapillära spåret och sedan dra in kapillären. En andra injektion kan utföras i controlateral halvklotet. </li><li> Sutur huden, desinficera, och att djuret att återhämta sig från anestesi såsom beskrivits tidigare i livmodern elektroporering (1,8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Stereotaxiska virala injektion. (A och B) Schematisk representation av de komponenter som behövs för att utföra stereotaktisk injektion (A) och en demonterad kapillär hållare visar införandet av en capillary tills den andra ringen (B). (C) Bild på musens huvud immobiliserade av örat barer och gomspalt stöd med huden skärs att exponera skallen (vänster). Förstoringen av den streckade boxen (till höger) visar de laterala och sagittala suturer, bregma, och injektionsstället (cirkel). 3. Behandling av provet <ol><li> One-to-tre veckor efter infektion, perfundera musen med ca. 100 ml 4% PFA, dissekera hjärnan och efter fixa det över natten i 4% PFA. Slutligen kan BrdU och / eller tamoxifen administreras före avlivning enligt olika paradigm för att undersöka cellcykelkinetiken och att stoppa uttrycket av de virala transgener flankeras av loxP-ställen, respektive 9. </li><li> Hjärnan kan sedan bearbetas för att immunfärgning med flera markörer för stam-och progenitorceller och neuroner (t.ex. Sox2, GFAP, nestin, Tbr2, doublecortin, etc). </li></ol>

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

BA och FC har lämnat in en patentansökan som beskriver den villkorade expansionen av vuxna somatiska stamceller från cdk4/cyclinD1 virus (EP 10.160.288,6).

Ett kritiskt steg i livmodern elektroporering är kvalitet och renhet av DNA sedan riktade migrering vid leverans av de elektriska fälten beror på dess laddning. Protokoll för DNA-rening som inte inkluderar avlägsnande av ytterligare laddade molekyler, såsom endotoxiner, kan leda till maskering av de naturliga DNA negativa laddningar leder till dålig leverans. Klart att vidröra livmoder väggar med elektroderna så nära som möjligt till det område som ska inriktas förbättra elektroporering effektivitet. Lika viktigt är kvaliteten av elektroderna som används eftersom detta är grundläggande för leverans av optimala elektriska fält. Micro-repor inte ens synliga med ögat och / eller organiska rester, såsom spår av serum, lipider och så vidare, kommer oundvikligen ackumuleras över tiden leder till elektroder förlorar sina egenskaper. Gamla och / eller smutsiga electropes är den mest sannolika orsaken till en plötslig minskning i elektroporation effektivitet och därmed bör replaced så snart detta är märkt. Medan relativt enkel, i livmodern elektroporering normalt kräver några veckors utbildning för att uppnå tillfredsställande och reproducerbara resultat. Denna teknik är mycket mångsidig, eftersom den kan appliceras, praktiskt taget, till alla organ och vävnader av det utvecklande embryot. Visst, organ innehållande en hålighet, såsom hjärnan, är särskilt lätt att inrikta och möjliggöra en hög andel av transfekterade celler på grund av lättheten att injicera en relativt stor volym av DNA. Ett vanligt problem vid inrättandet stereotaxisk viral injektion är att ha några infekterade celler och / eller att inrikta sig oönskade områden. Det första problemet är huvudsakligen korrelerad med injektion av låg-titer virus. 293T celler med färre passager i kultur växer snabbare och leda till högre virustitrar. Använda celler äldre än ca. 20 passager rekommenderas inte och medel för transfektion med mindre än 80% effektivitet inte kan garantera ett braviral produktion. Återsuspension av virala pelleten är också kritisk, har den virala suspensionen ska visas homogena och virala klumpar som kan täppa till kapillären måste undvikas. Virus är mycket känsliga för temperaturen sjunker och långtidslagring. Av detta skäl, alikvoter måste lagras permanent vid -80 ° C och kan inte frysas. Även under dessa betingelser, kan en minskning i infektivitet observeras efter 6-12 månaders lagring. I inlärningsfaser föreslår vi att testa virustiter av varje virus förberedelser och att göra det igen efter långtidsförvaring. Närvaron av infekterade celler i oönskade områden av hjärnan kan bero på en suboptimal placering av musens huvud på stereotaxisk ram, som kräver lite övning. Dessutom är det viktigt att inte skada ytan av hjärnan när du öppnar hålet på skallen för annars kommer det inte att vara möjligt att återställa 0 korrekt på pial ytan, vilket resulterar i inexakt injektion. Koordinaternaatt vi i detta protokoll kallas C57/BL6 6-10 veckor gamla honor och vi föreslår att optimera dem för olika påfrestningar / ålder / kön. Förvärv av denna teknik kan kräva mer tid än i livmodern elektroporering grund av längre faserna som behövs för att förbereda virus och analysera proverna. Vi rekommenderar starkt att virus endast används efter mus kirurgi och stereotaktisk injektion har blivit pålitlig och reproducerbar. Det första steget för att uppnå detta är att injicera cell-genomträngande DNA färgämnen, såsom Hoechst 33342, i euthanized möss och analysera hjärnan omedelbart. I livmodern elektroporering och stereotaxisk viral injektion är två kraftfulla system till akut och vävnads-specifikt manipulera genuttryck i CNS under däggdjur utveckling och vuxenlivet. Trots deras begränsning i inriktning endast en subpopulation av celler, dessa system ger en hög hastighet, och lätt jämfört med mer konventionella metoder, in synnerhet arbets-och tidskrävande generering av transgena möss. Trots denna likhet, flera skillnader mellan de två teknikerna som är värda att nämna. Först, med hänsyn till inriktningen av olika celltyper, i livmodern elektroporering initialt leder till transfektion av stamceller egentliga (även kallad radiella gliaceller) eftersom dessa är de enda celler som avgränsar kammaren där DNA injiceras. Som en följd av celldelningar kommer plasmider därefter ärvt från riktade, celler mor stamceller till sin stamfader och / eller neuronala celler dotter som leder till omfördelning av transfekterade celler i hela cortex som en funktion av tiden. I motsats, leder användningen av HIV lentivirus i den vuxna hjärnan till samtidig infektion av vilken celltyp som helst, inklusive stamceller, progenitorceller, neuroner samt mogna gliaceller. Att notera, med avseende på använda HIV lentivirus i motsats till mer vanliga retrovirus är det faktumatt Lentiviral integration skulle ske oberoende av den mitotiska tillståndet hos celler, vilket gör det möjligt att rikta även av vuxna, vilande stamceller. Det andra, är en annan viktig skillnad mellan elektroporering och viral infektion som en övergående, episomal expression uppnås genom den förstnämnda i motsats till den irreversibla integrering av DNA i genomet hos infekterade celler uppnås genom den senare. Som ett resultat av konsekutiva celldelningar, utspädning av elektroporerade plasmiderna, och nedbrytning av det ektopiska cyclinD1 proteinet, skulle följa vid varje cellcykel. Således var utbyggnaden av NSC under fosterutvecklingen visas endast varar ca två dagar 15 medan den vuxna hjärnan denna effekt befanns varar i flera månader (opublicerade resultat). Tredje, eftersom jag) cdk4/cyclinD1 har en starkare effekt på celler med en längre G1 och ii) begicks neurala stamceller under utveckling en längre cellcykelnän stamceller medan motsatsen gäller även i vuxen ålder, våra två manipulationer fann att utlösa expansionen i första hand av neurala stamceller under utveckling och stamceller i vuxen ålder. I båda fallen en ökning i neuroner har uppnåtts genom båda metoderna. Fjärde, virala injektion kan lätt utföras, tillförlitligt och reproducerbart, i många olika regioner i den vuxna hjärnan genom att helt enkelt ändra stereotaxiska koordinater. Däremot kan exakt inriktning av vissa regioner i det centrala nervsystemet, såsom hjärnstammen, hippocampus bildandet eller ryggmärgen, genom in utero elektroporering vara svårare att uppnå reproducerbart. Dessutom, medan stereotaktisk injektion kan utföras på möss i alla åldrar, är optimal prestanda i livmodern elektroporering begränsad från ca E11 till E16. Faser före E11 skulle kräva antingen använda ett ultraljud backscatter mikroskop 18,19 eller en hel embryo kulture-systemet 17,20. Nyligen har ett ökande intresse för grundläggande cellbiologi av somatiska stamceller blivit befordrad eftersom deras studier och manipulation tros vara grundläggande för att utveckla nya cellbaserade regenerativa terapier. I synnerhet för överexpression av cdk4/cyclinD1, ger vår protokoll medel för att övergående öka expansionen av NSC i vivo (Figur 3B och C och 4B och C) i syfte att öka antalet neuroner som genereras i den vuxna hjärnan. Vi tror att dessa manipulering kan vara viktig i ett antal olika sammanhang för att bättre förstå betydelsen av NSC i hjärnans utveckling, utveckling och homeostas samt deras bidrag till kognitiv funktion eller återhämtning från neural degeneration eller skada.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / utrustning </td><td> Leverantör </td><td> Katalog # </td><td></td></tr><tr><td> Endofree maxi plasmid kit </td><td> Qiagen </td><td> 12.362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brun pipett avdragare </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas kapillärer med glödtråd </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Bordsskiva försöksdjur anestesi-system </td><td> VetEquip </td><td> 901.806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 glaspärla autoklav </td><td> Southpointe Kirurgiska </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris pincett </td><td> WPI </td><td> 15.917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona lösning </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pico Pump </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 fyrkantsvåg elektroporator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450.052 </td><td></td></tr><tr><td> Runda pincett elektroder </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Suturmaterial </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> Reflexklämanbringaren för sårtillslutning </td><td> WPI </td><td> 500.345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic injektionslösning </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt Bovin Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15.140 </td><td></td></tr><tr><td> Vävnadsodlingsskål </td><td> Falcon </td><td> 353.003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyetylenimin 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> n-smörsyra, natriumsalt </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Rör, thinwall, polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Modell 900 små djur stereotaxiskt instrument </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI pico mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 kontroller och Nanoliter2000 injektor </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Glas ersättning 3,5 nanoliter </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR borr allmän giltighet </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Antikropp </td><td> Leverantör </td><td> Katalog # </td><td> Utspädning </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556.309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Tabell över antikroppar. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Somatiska stamceller kan dela att skapa ytterligare stamceller (expansionen) eller mer differentierade celltyper (differentiering), vilket är grundläggande för vävnadsbildning under embryonal utveckling och vävnad homeostas under vuxenlivet 1. För närvarande är stora ansträngningar investeras för att kontrollera byte av somatiska stamceller från expansion till differentiering eftersom detta anses vara grundläggande för att utveckla nya strategier för regenerativ medicin 1,2. Dock är en stor utmaning i studien och användningen av somatiska stamceller att deras expansion har visat sig vara mycket svårt att kontrollera. Här beskriver vi ett system som medger styrning av neurala stam / progenitorceller (helt kallat NSC) expansion i mus embryonala cortex eller den vuxna hippocampus genom att manipulera uttrycket av cdk4/cyclinD1 komplexet, en större regulator av G1-fasen av cellcykeln och somatiska stamceller differentiation 3,4. Specifikt är två olika tillvägagångssätt beskrivs av vilken cdk4/cyclinD1 komplexet överuttrycks i NSC in vivo. Genom den första metoden, är överuttryck av regulatorerna cellcykelns erhållits genom injicering plasmider som kodar för cdk4/cyclinD1 i lumen hos musen telencefalon följt av in utero elektroporering för att leverera dem till NSC av den laterala cortex, således utlöser episomal expression av transgener 5-8. Genom den andra metoden, är mycket koncentrerade HIV-härledda virus stereotaktiskt injiceras i gyrus dentatus av den vuxna musens hippocampus således utlöser konstitutiv expression av regulatorerna cellcykelns efter integration av den virala konstruktet i genomet hos infekterade celler 9. Båda metoder, vars grundläggande principer redan beskrivits av andra video protokoll 10-14, var här optimerad för i) minska vävnadsskada, ii) mål breda delar av mycket specifika hjärnans regions, iii) erhålla höga antal manipulerade celler inom varje region, och iv) utlösa höga expressionsnivåer av transgenerna i varje cell. Övergående överuttryck av transgener som använder två metoder erhålls på olika sätt dvs genom naturlig utspädning av elektroporerade plasmider grund celldelning eller tamoxifen administration i Cre-uttryckande NSC infekterade med virus som bär cdk4/cyclinD1 flankeras av loxP-ställen, respektive 9,15 . Dessa metoder ger en mycket kraftfull plattform för att akut och vävnads-specifikt manipulera uttrycket av en gen i mushjärna. I synnerhet, genom att manipulera uttrycket av cdk4/cyclinD1 komplexet, tillåter vårt system den tidsmässiga kontrollen av NSC expansion och deras övergång till differentiering, vilket slutligen ökar antalet neuroner genererade i däggdjurshjärnan. Vår strategi kan vara av avgörande betydelse för grundforskning och använda somatiska stamceller för behandlingav centrala nervsystemet hos däggdjur samtidigt som en bättre förståelse för i) stamceller bidrag till vävnadsbildning under utveckling, ii) vävnader homeostas under vuxenlivet, iii) rollen av vuxen neurogenes i kognitiva funktioner, och kanske, iv) bättre med somatiska stamceller celler i modeller av neurodegenerativa sjukdomar.

<ol><li> Sammantaget, i livmodern elektroporering ger 60-80% av elektroporerade embryon uppvisar starkt uttryck av reportergenen i ett brett område av den laterala kortex (figur 3A). Fluorescerande proteiner kan lätt detekteras på hela mount embryon så snart som 3-6 timmar efter operation med signalen varar mer än en vecka. Inom målområdet, ca 30-50% av cellerna uttrycker vanligen transgenen (er) med andelen celler som samuttrycker två (eller flera) sam-elektroporerade transgener är vanligen över 90% (Figur 3B, till vänster) 6,8 , 15. Medan en minimal nivå av apoptos (ca 2,0-2,5%) kunde observeras efter ca 2 timmar från elektroporation, kommer detta värde att återgå till fysiologiska nivåer (ca 0,5-1,0%) efter ca 6 timmar (FC, opublicerade data). Andelen av embryon eller gravida möss dör på grund av operationen är typiskt försumbar (&lt;5%). Co-elektroporering med cdk4/cyclinD1 under dessa förhållanden följt av 48 timmar utveckling utlöser en ökning av utbyggnaden av neurala stamceller med 30% (Figur 3B, höger och C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Expansion av neurala progenitorceller från cdk4/cyclinD1 överexpression. (A) Fluorescens bild av en sektion genom den laterala cortex av en musembryo 24 timmar efter elektroporering med GFP och RFP-plasmider vid embryonal dag 13. (B) Fluorescerande bilder som i en 48 timmar efter sam-elektroporering med cdk4/GFP och cyclinD1/RFP plasmider och immunomärkning för den basala stamfader markören Tbr2. Fluorescerande reportrar med DAPI counterstainig (vänster) och Tbr2 (höger) visas. Linjer indikerar den apikala ytan av den ventrikulära zonen (VZ, vit linje) och gränserna för den subventrikulära zonen (SVZ, gula streckade linjer). Notera den ökade thickness av SVZ i den elektroporerade delen av hjärnbarken (vita pilspetsar) på grund av en ökad produktion och expansion av basala progenitorer efter överuttryck av cdk4/cyclinD1. (C) Kvantifiering av effekten som visas i B. Bars = SD, p &lt;0,05, n = 3. Stapeldiagram i C tas från Lange et al. 2009 15. <ol start="2"><li> Efter viral stereotaktisk injektion, ca. 80% av opererade möss uppvisar starkt uttryck av transgener hela dentate gyrus. Konstitutiv expression av GFP kan enkelt detekteras på 40 um sektioner så snart som 4 dagar efter operationen. Längs rostralt till kaudalt axel gyrus dentatus, cirka 10-30% av cellerna (motsvarande totalt ca. 10,000-30,000 celler) uttrycker vanligtvis transgenen (er) (Figur 4A) 9. Andelen möss dör på grund av operationen är försumbar (&lt;5%). Tre veckors överuttryck av cdk4/cyclinD1 under dessa förhållanden utlöser en ökning av NSC med över två-veck (Figur 4B), medan minskande neurogenes med 70% (Figur 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Effekter av virusinfektion. (A) 3D-rekonstruktion av 7 fluorescens bilder tagna från 40 um tjocka seriella koronala sektioner (insamling 1 var 6) längs den rostralt till kaudalt axel av hippocampus. GFP + infekterade celler (grön) och DAPI nukleär färgning (blå) i gyrus dentatus visas (överst). Ljusfält bilder av koronala sektionerna motsvarar de som visas i A (mitten) och 3D-representation (botten) av hela hjärnhalva med hippocampus markerad i grönt pseudofärger (modifierad från Allen Brain Atlas, <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Vita pilar pekar injektionsstället. Lateral (L), rostralt (R), och dorsal (D) axlar (x, y, och z koordinaterna stereotaxisk) indikeras (höger). (B och C) Andel nestin + NSC (B) och DCX + nyfödda nervceller (C) i befolkningen i GFP + infekterade celler 3 veckor efter stereotaktisk injektion av GFP (vit) eller cdk4/cyclinD1/GFP (svart) virus. Staplar = SD, p &lt;0,005, n = 3. Grafer i B och C från Artegiani et al., 2011.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Styra expansionen av somatiska stamceller är en viktig faktor som hämmar deras studier och användning i terapi. Här beskriver vi ett system för att temporärt kontrollera neurala stamceller expansion under utveckling och vuxen ålder, vilket kan användas för att öka antalet neuroner genereras i mushjärna.

Utbyggnad av embryonala och vuxna neurala stamceller genom<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaxisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Tillväxt och differentiering av vuxna hippocampus Arctic Neurala jordekorre Stamceller

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Lokalt Transgena råttor genom<em&gt; I livmodern</em&gt; Elektroporering och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktisk injektion av en viral vektor för villkorad Gene Manipulation i ryggmärgen hos möss

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

En cGMP-tillämplig Expansion Metod för aggregat av mänskliga neurala Stem och stamceller härledas från pluripotenta stamceller eller fosterhjärnvävnad

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolering och kultur av embryonala mus neurala stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo direkt omprogrammering av bosatta gliaceller i interneuroner genom intracerebral injektion av virala vektorer

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...