Name: detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video at JoVE.com

Het werk werd ondersteund door de NIH R01 NS071039-01A1 onderzoek te verlenen.

1. Isolatie van Microglia van Normaal CNS Isolatie van microglia uitgevoerd zoals eerder beschreven wijzigingen 3. <ol><li> Bereid instrumenten voor dissectie en perfusie: schaar, pincet, 10 ml spuit met 27g naald, 15 ml Dounce homogenisator (Teflon / glas), 40 micrometer nylon cel zeef, 40% en 70% Percoll oplossingen, 1X PBS. </li><li> Euthanaseren muizen door middel van snelle stikken (ontheffing van zuurstof) de CO 2-camera en direct overbrengen naar laboratoriumta...

<ol>
	<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain.">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li><li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+CNS+inflammation.">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation.">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li><li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling.">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li><li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C/EBPbeta.">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C/EBP-alpha-PU.1+pathway.">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li><li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators.">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li><li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+cancer+development.">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li><li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+MicroRNA+Profiling:+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs.">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).</li></ol>

Onlangs grote belangstelling werd gegeven aan microglia en de betrokkenheid van deze cellen in een groot aantal pathologieën geassocieerd met neuroinflammatie en neurodegeneratie. Daarnaast is de rol van microRNA&#39;s in de differentiatie van immuun-en kankercellen sterk gegroeid de afgelopen jaren 5,10. We hebben recent de rol van miR-124 in het onderhoud van niet-geactiveerde of rust-fenotype van microglia in normale CNS 7, maar de rol van de andere soorten van microRNA&#39;s in de microglia fe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Kunnen worden bereid uit droge componenten in het laboratorium, pH: 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Kunnen worden bereid uit droge componenten in het laboratorium, pH: 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml van 100% Percoll wordt bereid door 10 ml 10X PBS en 90 ml Percoll van Sigma. 50 ml 70% Percoll isbereid door 35 ml van 100% Percoll en 15 ml DMEM 50 ml 40% Percoll wordt bereid door 20 ml van 100% Percoll en 30 ml PBS 1X </td></tr><tr><td> MOG 35-55 peptide </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> Difco </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Pertussistoxine </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR blokkerende antilichamen </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAb </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Kan gebruikt worden met verschillende fluoroforen (bijv. AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAb&#39;s </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Kan gebruikt worden met verschillende fluoroforen (bv. APC) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Verdun 1:15 in PBS 1X </td></tr><tr><td> 15% TBE-Urea Gel </td><td> Life Technologies Inc </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Testen MMU-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Testen snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Nuclease-vrij water </td></tr><tr><td> 384-wells duidelijke optische reactieplaat </td&gt; <td> Life Technologies Inc </td><td> 4309849 </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere platen (bijv. 96 wei-plaat) in verschillende real-time PCR instrumenten </td></tr><tr><td> Dounce homogenisator (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / glas </td></tr><tr><td> 40 μ nylon cel zeef </td><td> Valk </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Big centrifuge </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotor diameter 18,5 cm </td></tr><tr><td> Kleine centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotor diameter 6,5 cm </td></tr><tr><td> Real-time PCR-instrument </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AB 7900 HT </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten </td></tr><tr><td> NanoDrop spectrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> NanoDrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation

Microglia cellen van de myeloïde afstamming die zich in het centrale zenuwstelsel (CNS) 1. Deze cellen spelen een belangrijke rol in de pathologie van de vele ziekten die samenhangen met neuroinflammatie zoals multiple sclerose (MS) 2. Microglia in een normale CNS te uiten macrofaag marker CD11b en vertonen een rust-fenotype met het uitspreken van een laag niveau van activatie markers zoals CD45. Tijdens de pathologische gebeurtenissen in het CZS, microglia geactiveerd zoals bepaald worden door verhoogde expressie van CD45 en andere markers 3. De factoren die microglia fenotype en functies in het centraal zenuwstelsel aantasten zijn niet goed onderzocht. MicroRNA (miRNAs) zijn een groeiende familie van geconserveerde moleculen (~ 22 nucleotiden lang) die betrokken zijn bij veel normale fysiologische processen, zoals celgroei en-differentiatie 4 en aandoeningen zoals ontsteking 5. MiRNAs downregulate de expressie van bepaalde genen door binding complementaire sequenties van deir. mRNA&#39;s en spelen een belangrijke rol in de activering van aangeboren immuunsysteem cellen waaronder macrofagen 6 en microglia 7. Om te onderzoeken miRNA gemedieerde paden die de microgliale fenotype, biologische functie te definiëren, en om microglia te onderscheiden van andere vormen van macrofagen, is het belangrijk om kwantitatief beoordelen van de expressie van bepaalde microRNA&#39;s in verschillende subsets van CNS-ingezeten microglia. Gemeenschappelijke methoden voor het meten van de expressie van miRNAs in het centraal zenuwstelsel zijn onder andere kwantitatieve PCR uit hele neuronaal weefsel en in situ hybridisatie. Echter, kwantitatieve PCR van hele weefsel homogenaat niet wordt het mogelijk de expressie van miRNA in microglia die slechts 5-15% van de cellen van neuronale weefsel vormen. Hybridisatie in situ laat de evaluatie van de expressie van microRNA in specifieke celtypen in weefselcoupes, maar deze methode is niet geheel kwantitatief. In dit rapport beschrijven we een kwantitatieve en senstieve methode voor de detectie van miRNA door real-time PCR in microglia geïsoleerd van normale CNS of tijdens neuroinflammatie met behulp van experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE), een muismodel voor MS. De beschreven methode zal nuttig zijn om het niveau van expressie van microRNA&#39;s in microglia in normale CNS of tijdens neuroinflammatie in verband met diverse aandoeningen zoals MS, beroerte, traumatisch letsel, de ziekte van Alzheimer en hersentumoren te meten.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video at JoVE.com

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video (Video) | JoVE

Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA&#39;s in de microglia.

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice Video (Video) | JoVE

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System Video (Video) | JoVE

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow Video (Video) | JoVE

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy Video (Video) | JoVE

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR Video (Video) | JoVE

Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes Video (Video) | JoVE

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time Video (Video) | JoVE

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR Video (Video) | JoVE

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR Video (Video) | JoVE

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material Video (Video) | JoVE

Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...