Name: detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00
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Die Arbeit wurde durch die NIH R01 NS071039-01A1 Forschungsstipendium unterstützt.

1. Isolierung der Mikroglia von normalen ZNS Isolierung von Mikroglia wird wie zuvor mit Modifikationen 3 beschrieben durchgeführt. <ol><li> Bereiten Sie Instrumente zur Präparation und Perfusion: Scheren, Pinzetten, 10 ml Spritze mit Nadel 27g, 15 ml Dounce Homogenisator (Teflon / Glas), 40 mu m Nylon Zellsieb, 40% und 70% Percoll-Lösungen, 1X PBS. </li><li> Einschläfern Mäusen durch schnelles Ersticken (Entzug von Sauerstoff) in CO 2-Kamera und sofort übertrag...

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	<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain.">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li><li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+CNS+inflammation.">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation.">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li><li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling.">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li><li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C/EBPbeta.">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C/EBP-alpha-PU.1+pathway.">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li><li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators.">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li><li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+cancer+development.">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li><li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+MicroRNA+Profiling:+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs.">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).</li></ol>

Kürzlich wurde großes Interesse an Mikroglia und Beteiligung dieser Zellen bei vielen Erkrankungen, die mit Neuroinflammation und Neurodegeneration verbunden gegeben. Darüber hinaus wurde die Rolle von microRNAs bei der Differenzierung von Immun-und Krebszellen sich in den letzten Jahren gewachsen 5,10. Wir haben zuvor die Rolle der miR-124 in der Wartung von nicht-aktivierten oder ruhenden Phänotyp der Mikroglia im normalen ZNS-7 berichtet, aber die Rolle der anderen Arten von Mikro-RNAs in Mi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> 7,2-7,4: Kann aus trockenen Komponenten im Labor, pH-Wert hergestellt werden </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> 7,2-7,4: Kann aus trockenen Komponenten im Labor, pH-Wert hergestellt werden </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana Kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml 100% Percoll wird durch Mischen von 10 ml 10X PBS und 90 ml Percoll hergestellt von Sigma. 50 ml von 70% Percoll isthergestellt durch Mischen von 35 ml 100% Percoll und 15 ml DMEM 50 ml 40% Percoll wird, indem man 20 ml 100% Percoll und 30 ml 1X PBS hergestellt </td></tr><tr><td> MOG-Peptid 35-55 </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Pertussis-Toxin </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR blockierende Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAk </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Kann mit unterschiedlichen Fluorophoren (zB AF488) verwendet werden </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mABs </td><td> BioLegend </td><td> 103116 </td><td> Kann mit unterschiedlichen Fluorophoren (zB APC) verwendet werden </td></tr><tr><td> ParaformalBenzaldehyd (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Verdünnen 01.15 in 1X PBS </td></tr><tr><td> 15% TBE-Harnstoff-Gel </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Reverse Transkription-Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Assays MMU-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Nuklease-freies Wasser </td></tr><tr><td> 384-Well-Platte klare optische Reaktion </td&gt; <td> Life Technologies Inc. </td><td> 4309849 </td><td> Kann mit anderen Platten (z. B. 96-Well-Platte) in verschiedenen Real-Time PCR Instrumente ersetzt werden </td></tr><tr><td> Dounce-Homogenisator (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / Glas </td></tr><tr><td> 40 μ Nylon Zellsieb </td><td> Falke </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Big Zentrifuge </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotordurchmesser 18,5 cm </td></tr><tr><td> Kleinzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotordurchmesser 6,5 cm </td></tr><tr><td> Real-time PCR-Instrument </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Kann mit anderen Instrumenten ersetzt werden </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Kann mit anderen Instrumenten ersetzt werden </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Kann mit anderen Instrumenten ersetzt werden </td></tr><tr><td> Nanodrop Spektralphotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation

Mikroglia sind Zellen der myeloischen Linie, die im zentralen Nervensystem (ZNS) 1 befinden. Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Pathologie vieler Krankheiten, die mit Neuroinflammation wie Multiple Sklerose (MS) 2 verbunden ist. Mikroglia bei einem normalen ZNS auszudrücken Makrophagen-CD11b und weisen eine Ruhestätte Phänotyp durch die Expression niedrigen Aktivierungsmarker wie CD45. Während pathologischen Prozessen im ZNS, werden Mikroglia aktiviert, bestimmt durch Hochregulation von CD45 und andere Marker 3. Die Faktoren, die Mikroglia-Phänotyp und Funktionen im ZNS betreffen sind nicht gut untersucht. MicroRNAs (miRNAs) sind eine wachsende Familie von konservierten Molekülen (~ 22 Nukleotide lang), die in vielen normalen physiologischen Prozesse wie Zellwachstum und Differenzierung 4 und Krankheiten wie Entzündungen 5 beteiligt sind. MiRNAs herunterregulieren die Expression bestimmter Zielgenen durch Binden komplementärer Sequenzen derir mRNAs und spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des angeborenen Immunsystems Zellen, einschließlich Makrophagen 6 und Mikroglia 7. Um miRNA-vermittelten Pfade, die Mikroglia-Phänotyp, biologische Funktion zu definieren, und Mikroglia von anderen Arten von Makrophagen zu unterscheiden zu untersuchen, ist es wichtig, quantitative Erfassung der Expression bestimmter microRNAs in verschiedenen Teilmengen von CNS-ansässigen Mikroglia. Gängige Methoden zur Messung der Expression von miRNAs im ZNS gehören quantitative PCR aus ganzen neuronalen Gewebe und in situ Hybridisierung. Allerdings ist die quantitative PCR aus ganzen Gewebehomogenat nicht zulassen, die Bewertung der Expression von miRNA in Mikroglia, die nur 5-15% der Zellen des neuronalen Gewebes darstellen. In-situ-Hybridisierung erlaubt die Beurteilung der Expression von microRNA in spezifischen Zelltypen in den Gewebeschnitten, aber diese Methode ist nicht ganz quantitativ. In diesem Bericht beschreiben wir eine quantitative und Sensitive Methode zum Nachweis von miRNA durch real-time PCR in Mikroglia von normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), ein Mausmodell für MS isoliert. Das beschriebene Verfahren wird nützlich sein, um die Höhe der Expression von microRNAs in Mikroglia im normalen ZNS oder während Neuroinflammation mit verschiedenen Pathologien wie MS, Schlaganfall, traumatische Verletzungen, die Alzheimer-Krankheit und Hirntumoren zu messen.

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Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation (Video) | JoVE 

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

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Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

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Forschung

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