Name: detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video at JoVE.com

העבודה נתמכה על ידי R01 NIH NS071039-01A1 מענק מחקר.

1. הבידוד של microglia מ CNS רגיל הבידוד של microglia מבוצעת כפי שתואר קודם לכן עם שינויים 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מכשירים לנתיחה ו זלוף: מספריים, מלקחיים, 10 מ&quot;ל מזרק עם מחט 27g, 15 מ&quot;ל Dounce homogenizer (טפלון ...

<ol>
	<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain.">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li><li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+CNS+inflammation.">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation.">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li><li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling.">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li><li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C/EBPbeta.">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C/EBP-alpha-PU.1+pathway.">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li><li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators.">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li><li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+cancer+development.">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li><li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+MicroRNA+Profiling:+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs.">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).</li></ol>

לאחרונה עניין רב ניתנה microglia ומעורבות של תאים אלה מחלות רבות הקשורות neuroinflammation ו ניוון מוחיים. בנוסף, התפקיד של מיקרו RNA של התמיינות של תאים חיסוניים וסרטן גדל באופן דרמטי על 5,10 מספר השנים האחרונות. דיווחנו בעבר את התפקיד של miR-124 בשמירה על הפנוטיפ לא פעיל או מנוחה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> אפשר להכין מכל המרכיבים היבשים pH מעבדה,: 7.2-7.4 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> אפשר להכין מכל המרכיבים היבשים pH מעבדה,: 7.2-7.4 </td></tr><tr><td> DMEM, FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965, 10438 </td><td></td></tr><tr><td> miRVana ערכת </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> סיגמא </td><td> P4937-500 מ&quot;ל </td><td> 100 מ&quot;ל של Percoll 100% מוכן על ידי ערבוב 10 מ&quot;ל של PBS 10X ו 90 מ&quot;ל של Percoll מ Sigma. 50 מ&quot;ל של Percoll 70% הואשהוכן על ידי ערבוב של 35 מ&quot;ל של Percoll 100% ו 15 מ&quot;ל של DMEM 50 מ&quot;ל של Percoll 40% מכינים על ידי ערבוב של 20 מ&quot;ל Percoll 100% ו - 30 מ&quot;ל של 1X PBS </td></tr><tr><td> ש&quot;א 35-55 פפטיד </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> שעלת רעלן </td><td> סיגמא </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FCR חסימת נוגדנים </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> נגד CD11b - PE MAB </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> ניתן להשתמש fluorophores שונים (למשל AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 מבז </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> ניתן להשתמש fluorophores שונים (לדוגמא: APC) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> לדלל 1:15 ב 1X PBS </td></tr><tr><td> 15% TBE-דשן ג&#39;ל </td><td> החיים טכנולוגיות בע&quot;מ </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> הפוך TaqMan MicroRNA תמלול Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan יוניברסל PCR מיקס מאסטר </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan מבחני microRNA MMU-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 מזהה 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan מבחני microRNA snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 מזהה 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Nuclease ללא מים </td></tr><tr><td> 384 גם ברור התגובה אופטי צלחת </tד&gt; <td> החיים טכנולוגיות בע&quot;מ </td><td> 4309849 </td><td> ניתן להחליף עם לוחות אחרים (למשל 96 צלחת היטב) בזמן אמת מכשירים שונים ה-PCR </td></tr><tr><td> Dounce homogenizer (15 מ&quot;ל) </td><td> ויטון המדע מוצרים. </td><td> 358044 </td><td> טפלון / זכוכית </td></tr><tr><td> 40 ניילון μ תא מסננת </td><td> בז </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> ביג צנטריפוגות </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> רוטור בקוטר 18.5 ס&quot;מ </td></tr><tr><td> קטן צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> R 5415 </td><td> רוטור בקוטר 6.5 ס&quot;מ </td></tr><tr><td> בזמן אמת PCR Instrument </td><td> החיים טכנולוגיות בע&quot;מ </td><td> AB 7900 HT </td><td> ניתן להחליף עם מכשירים אחרים </td></tr><tr><td> תזרים cytometer </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> ניתן להחליף עם מכשירים אחרים </TD&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> ניתן להחליף עם מכשירים אחרים </td></tr><tr><td> Nanodrop ספקטרופוטומטר </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation

Microglia הם תאים של שושלת מיאלואידית הנמצאים במערכת העצבים המרכזית (CNS) 1. תאים אלה ממלאים תפקיד חשוב פתולוגיות של מחלות רבות הקשורות neuroinflammation כמו טרשת נפוצה (MS) 2. Microglia בעוד כמה CNS רגילים להביע CD11b מקרופאג סמן ולהציג פנוטיפ מנוחה בהבעת רמות נמוכות של סמנים הפעלה כגון CD45. במהלך אירועים פתולוגיים מערכת העצבים המרכזית, microglia להיות מופעל כפי שנקבע על ידי upregulation של CD45 ו סמנים אחרים 3. הגורמים המשפיעים על הפנוטיפ microglia פונקציות מערכת העצבים המרכזית לא למד היטב. מיקרו RNA (miRNAs) משפחה הולך וגדל של מולקולות המשתמרים (~~~HEAD=NNS 22 נוקלאוטידים ארוך) כי הם מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים רבים רגילים כגון צמיחת תאים והתמיינות 4 ו מחלות כגון דלקת 5. MiRNAs downregulate את הביטוי של גנים מסוימים היעד של רצפים משלימים מחייב שלIR mRNAs ולשחק תפקיד חשוב ההפעלה של תאים חיסוניים מולדים כולל מקרופאגים 6 ו מיקרוגליה 7. על מנת לחקור מירנה בתיווך מסלולים המגדירים את הפנוטיפ microglial, פונקציה ביולוגית, להבדיל microglia מסוגים אחרים של מקרופאגים, חשוב להעריך כמותית את הביטוי של מיקרו RNA מסוימות תת שונים של מערכת העצבים המרכזית microglia תושב. השיטות המקובלות למדידת ביטוי miRNAs מערכת העצבים המרכזית כולל PCR כמותי מן הרקמה העצבית כולה ב ההכלאה באתרה. עם זאת, PCR כמותי מן homogenate הרקמה כולה אינה מאפשרת הערכת הביטוי של מירנה ב microglia, אשר מייצגים רק 5-15% מכלל התאים של הרקמה העצבית. ההכלאה באתרם מאפשרת הערכת הביטוי של microRNA של סוגי תאים מסוימים בסעיפים רקמות, אך שיטה זו אינה כמותית לחלוטין. בדו&quot;ח זה אנו מתארים כמותית sensשיטת itive לצורך זיהוי של מירנה על ידי בזמן אמת PCR ב microglia מבודד CNS רגילים או במהלך neuroinflammation באמצעות Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל העכבר על טרשת נפוצה. בשיטה המתוארת יהיה שימושי כדי למדוד את רמת הביטוי של מיקרו RNA ב microglia ב CNS רגילים או במהלך neuroinflammation קשור פתולוגיות שונות, כולל טרשת נפוצה, פגיעה שבץ, טראומה, מחלת אלצהיימר גידולים במוח.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video at JoVE.com

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video (Video) | JoVE

Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice Video (Video) | JoVE

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System Video (Video) | JoVE

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow Video (Video) | JoVE

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy Video (Video) | JoVE

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR Video (Video) | JoVE

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes Video (Video) | JoVE

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time Video (Video) | JoVE

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR Video (Video) | JoVE

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR Video (Video) | JoVE

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material Video (Video) | JoVE

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...