Name: detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00
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仕事はNIH R01 NS071039-01A1研究助成金によって支えられている。

1。ノーマルCNSからミクログリアの分離修正3で以前に説明したようにミクログリアの分離が実行されます。 <ol><li>はさみ、ピンセット、27グラム針、15ミリリットルダウンスホモジナイザー（テフロン/ガラス）、40μmのナイロンセルストレーナー、40％、70％パーコール溶液、1×PBSで10mlの注射器：解剖と血流のために楽器を準備します。 </li><li> CO 2カメラ...

<ol>
	<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain.">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li><li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+CNS+inflammation.">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation.">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li><li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling.">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li><li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C/EBPbeta.">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C/EBP-alpha-PU.1+pathway.">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li><li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators.">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li><li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+cancer+development.">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li><li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+MicroRNA+Profiling:+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs.">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).</li></ol>

最近大きな関心は、ミクログリアと神経炎症および神経変性に関連する多くの病態におけるこれらの細胞の関与に与えられた。さらに、免疫やがん細胞の分化におけるマイクロRNAの役割は劇的に過去数年間5,10を介して成長してきました。我々は以前通常のCNS ​​におけるミクログリアの非活性化または休止表現型の維持7でのmiR-124の役割を報告しているが、ミクログリアの?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> 7.2から7.4：pHは、実験室で乾燥成分から調製することができる</td></tr><tr><td> 10×PBS </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30258.02 </td><td> 7.2から7.4：pHは、実験室で乾燥成分から調製することができる</td></tr><tr><td> DMEM、FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> miRVanaキット</td><td>インビトロジェン</td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td>シグマ</td><td> P4937-500ミリリットル</td><td> 100％のパーコール100 mlの10×PBSの10mlおよびシグマからパーコールの90ミリリットルを混合して調製されています。 70％パーコールの50ミリリットルです。100％のパーコールの35ミリリットルの混合によって調製し、DMEM 15 mlの 40％の50ミリリットルパーコールは、100％のパーコールの20ミリリットルとの1X PBS 30mlを混合することによって調製された</td></tr><tr><td> 35から55のペプチドをモグ</td><td> AnaSpec株式会社</td><td> 60130から5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>シグマ</td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcRは、抗体をブロッキング</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553142 </td><td>クローン2.4G2 </td></tr><tr><td>抗CD11b - PEモノクローナル抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553311 </td><td>異なる蛍光色素（例えば、AF488）で使用することができます</td></tr><tr><td>抗CD45-APC-Cy7 mAbを</td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td>異なる蛍光色素（例えばAPC）で使用することができます</td></tr><tr><td> Paraformaldehyde（16％） </td><td> EMS社</td><td> 15710 </td><td> 1X PBSで1：15に希釈し</td></tr><tr><td> 15パーセントTBE-尿素ゲル</td><td>ライフ·テクノロジーズ·インク</td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan MicroRNAの逆転写キット</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqManユニバーサルPCRマスターミックス</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan MicroRNAのアッセイMMU-MIR-124A </td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan MicroRNAのアッセイsnoRNA-55 </td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td> AM9937 </td><td>ヌクレアーゼフリー水</td></tr><tr><td> 384ウェルクリア光反応プレート</tD&gt; <td>ライフ·テクノロジーズ·インク</td><td> 4309849 </td><td>別のリアルタイムPCR機器で他のプレート（例えば、96ウェルプレート）で置換することができます</td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー（15ミリリットル） </td><td>ウィートン科学製品。 </td><td> 358044 </td><td>テフロン/ガラス</td></tr><tr><td> 40μナイロンセルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td>大きな遠心</td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td>ローター直径18.5センチメートル</td></tr><tr><td>小型遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5415 R </td><td>ローター直径6.5センチメートル</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR装置</td><td>ライフ·テクノロジーズ·インク</td><td> AB 7900 HT </td><td>他の楽器で置換することができる</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td>他の楽器で置換することができる</TD&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> FACSAria </td><td>他の楽器で置換することができる</td></tr><tr><td>光度計分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>光度計1000年</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）1に存在する骨髄系の細胞である。これらの細胞は、例えば、多発性硬化症（MS）2などの神経炎症に関連付けられている多くの疾患の病態に重要な役割を果たしている。正常な中枢神経系におけるミクログリアはマクロファージマーカーCD11bを発現し、CD45などといった活性化マーカーの低レベルを発現させることにより、安静時の表現型を示す。 CNSの病理学的イベント中に、ミクログリアは活性としてCD45のアップレギュレーションおよび他のマーカー3で決定となります。 CNSのミクログリアの表現型や機能に影響を与える要因は十分に研究されていません。マイクロRNA（miRNA）は、細胞の増殖と分化4や5のような炎症の病態として、多くの正常な生理学的プロセスに関与している保存された分子（〜22ヌクレオチドの長さ）の成長の家族です。 miRNAが結合相補的な配列によって、特定の標的遺伝子の発現をダウンレギュレートIRは、mRNAとマクロファージ6とミクログリア7を含む先天性免疫細胞の活性化に重要な役割を果たしている。ミクログリアの表現型、生物学的機能を定義し、マクロファージの他のタイプのミクログリアを区別するためのmiRNA-介在経路を調査するためには、定量的にCNS常駐ミクログリアの異なるサブセット内の特定のマイクロRNAの発現を評価することが重要である。 CNSにおけるmiRNAの発現を測定するための一般的な方法は、全体の神経組織からとin situハイブリダイゼーションの定量PCRが含まれています。しかし、全体の組織ホモジネートから定量PCRは、神経組織の細胞の唯一の5から15パーセントを表すミクログリアにおけるmiRNAの発現の評価をすることはできません。 in situでのハイブリダイゼーションは組織切片内の特定の細胞型におけるマイクロRNAの発現を評価できますが、このメソッドは完全に定量的ではありません。本報告では、定量的およびSENSを記述する通常のCNSから、または実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）、MSのマウスモデルを用いて、神経炎症時に単離されたミクログリアにおけるリアルタイムPCRによるmiRNAを検出するためのitive方法。記載された方法は、通常のCNSやMS、脳卒中、外傷、アルツハイマー病や脳の腫瘍を含む種々の病状に関連付けられている神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの発現レベルを測定することが有用であろう。

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Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video (Video) | JoVE

ミクログリアは中枢神経系の防衛と免疫監視の最初の行を提供するマクロファージを常駐しています。 microRNAはマクロファージの活性化と分化を含む多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす調節分子である。本稿では、ミクログリアにおけるマイクロRNAの測定方法を説明します。

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

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生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

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新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

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好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

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における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR Video (Video) | JoVE

リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

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ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time Video (Video) | JoVE

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR Video (Video) | JoVE

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

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ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

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リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...