Name: detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av NIH R01 NS071039-01A1 forskningsstipend.

1. Isolering av microglia fra Normal CNS Isolering av microglia utføres som beskrevet tidligere med modifikasjoner tre. <ol><li> Forbered instrumenter for disseksjon og perfusjon: sakser, pinsetter, 10 ml sprøyte med 27g nål, 15 ml Dounce homogenizer (Teflon / glass), 40 mikrometer nylon celle sil, 40% og 70% Percoll løsninger, 1X PBS. </li><li> Avlive mus ved rask kvelning (berøvelse av oksygen) i CO 2 kamera og umiddelbart overføre dem til laboratoriet for kir...

<ol>
	<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain.">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li><li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+CNS+inflammation.">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation.">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li><li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling.">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li><li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C/EBPbeta.">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C/EBP-alpha-PU.1+pathway.">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li><li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators.">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li><li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+cancer+development.">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li><li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+MicroRNA+Profiling:+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs.">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).</li></ol>

Nylig betydelig interesse ble gitt til microglia og involvering av disse cellene i mange patologi forbundet med neuroinflammation og neurodegeneration. I tillegg har rollen microRNAs i differensiering av immunsystemet og kreft celler dramatisk vokst de siste årene 5,10. Vi har tidligere rapportert rolle Mir-124 i vedlikehold av ikke-aktivert eller hvile fenotypen av microglia i normale CNS 7, men den rollen de andre typene microRNAs i microglia fenotype og aktivisering staten fortsatt å bli oppda...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Kan være forberedt fra tørre komponenter i laboratoriet, pH: 07.02 til 07.04 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Kan være forberedt fra tørre komponenter i laboratoriet, pH: 07.02 til 07.04 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml 100% Percoll er utarbeidet ved å blande 10 ml 10X PBS og 90 ml Percoll fra Sigma. 50 ml av 70% Percoll erutarbeidet av blanding av 35 ml 100% Percoll og 15 ml DMEM 50 ml av 40% Percoll er utarbeidet ved å blande 20 ml 100% Percoll og 30 ml 1X PBS </td></tr><tr><td> Mog 35-55 peptid </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Kikhoste gift </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FCR blokkerende antistoffer </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE MAB </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Kan brukes med forskjellige fluorophores (f.eks AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Kan brukes med forskjellige fluorophores (f.eks APC) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Fortynn 01:15 i 1X PBS </td></tr><tr><td> 15% TBE-Urea Gel </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan mikroRNA Analyser MMU-Mir-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan mikroRNA Analyser snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Nukleasefritt vann </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Nukleasefritt vann </td></tr><tr><td> 384-brønnen klar optisk reaksjon plate </td&gt; <td> Life Technologies Inc. </td><td> 4309849 </td><td> Kan erstattes med andre plater (f.eks plate med 96 brønner) i ulike real-time PCR instrumenter </td></tr><tr><td> Dounce homogenizer (15 ml) </td><td> Wheaton science produkter. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / glass </td></tr><tr><td> 40 μ nylon celle sil </td><td> Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Big sentrifuge </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotor diameter 18,5 cm </td></tr><tr><td> Liten sentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotor diameter 6,5 cm </td></tr><tr><td> Real-time PCR Instrument </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Kan erstattes med andre instrumenter </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Kan erstattes med andre instrumenter </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Kan erstattes med andre instrumenter </td></tr><tr><td> Nanodrop spektrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation

Microglia er celler av myeloid avstamning som bor i det sentrale nervesystemet (CNS) 1. Disse cellene spiller en viktig rolle i patologi av mange sykdommer forbundet med neuroinflammation som multippel sklerose (MS) 2. Microglia i en normal CNS uttrykke macrophage markør CD11b og viser en hvilende fenotype ved å uttrykke lave nivåer av aktivisering markører som CD45. Under patologiske hendelser i CNS, microglia bli aktivert som bestemmes av oppregulering av CD45 og andre markører tre. De faktorene som påvirker microglia fenotype og funksjoner i CNS er ikke godt undersøkt. MicroRNAs (miRNAs) er en voksende familie av bevarte molekyler (~~~HEAD=NNS 22 nukleotider lang) som er involvert i mange normale fysiologiske prosesser som cellevekst og differensiering 4 og patologi som betennelse 5. MiRNAs downregulate uttrykket av visse målgener ved å binde komplementære sekvenser avir mRNAs og spiller en viktig rolle i aktivering av medfødte immunceller inkludert makrofager 6 og microglia 7. For å undersøke miRNA-medierte mekanismer som definerer microglial fenotype, biologisk funksjon, og å skille microglia fra andre typer makrofager, er det viktig å kvantitativt vurdere uttrykket av bestemte microRNAs i forskjellige undergrupper av CNS-bosatt microglia. Vanlige metoder for å måle uttrykket av miRNAs i CNS omfatter kvantitativ PCR fra hele neuronal vev og in situ hybridisering. Men kvantitativ PCR fra hele vev homogenat ikke tillate vurderingen av uttrykket av miRNA i microglia, som representerer bare 5-15% av cellene i nevronale vev. Hybridisering in situ gjør vurderingen av uttrykket av mikroRNA i spesifikke celletyper i vevsdelene, men denne metoden er ikke helt kvantitativ. I denne rapporten beskriver vi en kvantitativ og Sensitive metode for påvisning av miRNA ved real-time PCR i microglia isolert fra vanlige CNS eller under neuroinflammation bruke eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), en mus modell for MS. Den beskrev metoden vil være nyttig for å måle nivået av uttrykk for microRNAs i microglia i normale CNS eller under neuroinflammation assosiert med ulike sykdommer inkludert MS, hjerneslag, traumatisk skade, Alzheimers sykdom og hjernesvulster.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation at JoVE.com 

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation (Video) | JoVE 

Microglia er bosatt makrofager som gir den første linjen i forsvaret og immun overvåking av det sentrale nervesystemet. MicroRNAs er regulatoriske molekyler som spiller en viktig rolle i mange fysiologiske prosesser deriblant aktivering og differensiering av makrofager. I denne artikkelen beskriver vi metoden for måling av microRNAs i microglia.

Påvisning av MicroRNAs i microglia av Real-time PCR i Normale CNS og under Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice (Video) | JoVE 

Real-time Imaging av Heterotypic Blodplate-nøytrofile interaksjoner på Aktivert Endotelet Under vaskulær inflammasjon og trombedannelse i levende mus

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System (Video) | JoVE 

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow Video (Video) | JoVE

Real-time Imaging av endotelceller-celle Junctions Under Neutrophil Sjele under fysiologiske Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy Video (Video) | JoVE

Real-time Imaging av myeloide celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmsvulster ved å spinne Disk Konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR Video (Video) | JoVE

Samtidig Kvantifisering av T-Cell Receptor Eksisjon Circles (TRECs) og K-Slette rekombinasjon Eksisjon Circles (KRECs) ved Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes Video (Video) | JoVE

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time Video (Video) | JoVE

Imaging Neutrofiler og monocytter i mesenterisk Veins av intraMikros på bedøvet Mus i sanntid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR Video (Video) | JoVE

genotyping av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; av Ribosomalt Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR Video (Video) | JoVE

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material Video (Video) | JoVE

Sanntid skjelvende-indusert konvertering analysen for påvisning av CWD prioner i Fecal materiale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...