Name: detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке НИЗ R01 NS071039-01A1 исследовательский грант.

1. Выделение Микроглия от нормальной ЦНС Выделение микроглии осуществляется, как было описано ранее с изменениями 3. <ol><li> Подготовка инструментов для вскрытия и перфузии: ножницы, пинцет, 10 мл шприц с иглой 27G, 15 мл Dounce гомогенизатор (Teflon / стекло), 40 мкм нейлон ячейки...

<ol>
	<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain.">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li><li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+CNS+inflammation.">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation.">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li><li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling.">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li><li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C/EBPbeta.">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C/EBP-alpha-PU.1+pathway.">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li><li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators.">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li><li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+cancer+development.">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li><li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Throughput+MicroRNA+Profiling:+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs.">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).</li></ol>

Недавно значительный интерес был дан микроглии и участие этих клеток во многих патологий, связанных с neuroinflammation и нейродегенеративные. Кроме того, роль микроРНК в дифференцировке иммунной и раковых клеток резко выросли за последние несколько лет 5,10. Ранее мы уже сообщали роль ми?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Может быть получен из сухих компонентов в лабораторных условиях, рН 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> 10х PBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Может быть получен из сухих компонентов в лабораторных условиях, рН 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> DMEM, FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965, 10438 </td><td></td></tr><tr><td> miRVana комплект </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Перколла </td><td> Сигма </td><td> P4937-500 мл </td><td> 100 мл 100% Перколла готовится путем смешивания 10 мл 10 раз PBS и 90 мл Перколла от Sigma. 50 мл 70% Перколла являетсяполучают путем смешивания 35 мл 100% Перколла и 15 мл DMEM 50 мл 40% Перколла готовится путем смешивания 20 мл 100% Перколла и 30 мл 1X PBS </td></tr><tr><td> Мог 35-55 пептидных </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Коклюш токсина </td><td> Сигма </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR блокирующих антител </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Клон 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE мАт </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Может использоваться с различными флуорофоров (например, AF488) </td></tr><tr><td> Анти-CD45-APC-Cy7 МАТ </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Может использоваться с различными флуорофоров (например, АПК) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Развести 1:15 в 1X PBS </td></tr><tr><td> 15% КЭ-мочевины гель </td><td> Life Technologies Инк </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan микроРНК обратной транскрипции Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan универсальная PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan микроРНК Анализы MMU-Мир-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan анализы snoRNA микроРНК-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Нуклеазы без воды </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Нуклеазы без воды </td></tr><tr><td> 384-а ясно оптических пластин реакции </tг&gt; <td> Life Technologies Инк </td><td> 4309849 </td><td> Может быть заменены другими плитами (например, 96 пластин) в различных реального времени инструментов ПЦР </td></tr><tr><td> Dounce гомогенизатор (15 мл) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Тефлон / стекло </td></tr><tr><td> 40 μ нейлоновый фильтр клетки </td><td> Сокол </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Большой центрифуги </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Диаметр ротора 18,5 см </td></tr><tr><td> Малый центрифуги </td><td> Эппендорф </td><td> 5415 R </td><td> Диаметр ротора 6,5 см </td></tr><tr><td> ПЦР в реальном времени инструмент </td><td> Life Technologies Инк </td><td> AB 7900 HT </td><td> Может быть заменен с другими инструментами </td></tr><tr><td> Проточный цитометр </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Может быть заменен с другими инструментами </TD&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Может быть заменен с другими инструментами </td></tr><tr><td> Nanodrop спектрофотометр </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of micrornas in microglia by real-time pcr in normal cns and during neuroinflammation

Микроглия являются клетками миелоидной линии, которые находятся в центральной нервной системе (ЦНС) 1. Эти клетки играют важную роль в патологии многих заболеваний, связанных с neuroinflammation таких как рассеянный склероз (РС) 2. Микроглия в нормальной нервной выразить макрофагов маркер CD11b и обладают отдыха фенотип, выражая низким уровнем активации маркеров, таких как CD45. При патологических событий в ЦНС, микроглии активируются, как это определено регуляция CD45 и другие маркеры 3. Факторы, влияющие на фенотип микроглии и функции в ЦНС не очень хорошо изучены. Микро РНК (миРНК) представляют собой растущую семью сохраняющихся молекул (~ 22 нуклеотидов), которые принимают участие во многих нормальных физиологических процессах, таких как рост и дифференцировку клеток 4 и патологий, таких как воспаление 5. МиРНК подавляют экспрессию определенных генов-мишеней путем связывания комплементарных последовательностей вл мРНК и играют важную роль в активации врожденного иммунитета клеток, включая макрофаги микроглии 6 и 7. С целью изучения микроРНК-опосредованного пути, которые определяют микроглии фенотип, биологические функции, и отличить микроглии от других видов макрофаги, важно, чтобы количественно оценить выражение частности микроРНК в различных подмножеств CNS-резидент микроглии. Общие методы измерения выражение микроРНК в ЦНС включает количественный ПЦР из цельного нейронной ткани и гибридизация. Тем не менее, количественный ПЦР из цельного гомогената ткани не позволяют оценить выражение микроРНК в микроглии, которые представляют собой лишь 5-15% клеток нейронов ткани. Гибридизации на месте позволяет оценить выражение микроРНК в специфические типы клеток в срезах ткани, но этот метод не совсем количественные. В этом докладе мы описываем количественных и Sensтельным методом для обнаружения микроРНК на ПЦР в реальном времени в микроглии изолирован от нормального ЦНС или при использовании neuroinflammation экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), модель мыши для MS. Описанный метод будет полезен для измерения уровня экспрессии микроРНК в микроглии ЦНС в норме или при neuroinflammation, связанных с различными патологиями, включая MS, инсульт, травмы, болезни Альцгеймера и опухолей головного мозга.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video at JoVE.com

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation Video (Video) | JoVE

Микроглия проживают макрофагов, которые обеспечивают первую линию защиты и иммунного надзора центральной нервной системы. Микро РНК являются регуляторные молекулы, которые играют важную роль во многих физиологических процессах, включая активацию и дифференциацию макрофагов. В этой статье мы опишем метод для измерения микроРНК в микроглии.

Обнаружение микроРНК в Микроглия по ПЦР в реальном времени в нормальном ЦНС и во время Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice Video (Video) | JoVE

Изображений в реальном времени из гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействий на активированного эндотелия Во сосудистого воспаления и тромбообразования в живых мышей

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System Video (Video) | JoVE

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow Video (Video) | JoVE

В режиме реального времени изображений эндотелиальных межклеточных соединений Во нейтрофилов Трансмиграция в физиологических Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy Video (Video) | JoVE

В режиме реального времени изображений миелоидных клеток Dynamics в<em&gt; Арс<sup&gt; Мин / +</sup</em&gt; Кишечная Опухоли на вращающемся диске конфокальной микроскопии

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR Video (Video) | JoVE

Одновременное количественное определение Т-клеточного рецептора иссечение Круги (TRECs) и K-Удаление рекомбинация Вырезание кругов (KRECs) по ПЦР в реальном времени

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes Video (Video) | JoVE

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time Video (Video) | JoVE

Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR Video (Video) | JoVE

генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR Video (Video) | JoVE

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material Video (Video) | JoVE

Реальном времени дрожат индуцированной Assay преобразования для обнаружения CWD прионов в фекалии

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...