Name: depletion and reconstitution of macrophages in mice
Uploaded: 2012-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en &quot;Grant i Aid for forskning&quot; fra Crohns og kolitt Foundation of Canada til LMS, som støttes av en kanadisk Association of Gastroenterology / Canadian Association of Health Research / Crohns og kolitt Foundation of Canada New Investigator Award.

1. Nedbrytende Makrofager Bruke klodronat-holdige Liposomer <ol><li> Liposomer lagres ved 4 ° C. To timer før injeksjonen, fjerne klodronat-holdige liposomer og PBS som inneholder liposomer, eller sterilt PBS (injeksjon kontroll) fra kjøleskapet for å tillate dem å akklimatisere seg til romtemperatur (18 ° C). </li><li> Invertere rør som inneholder liposomer 8-10 ganger for å sikre en jevn fordeling før du legger 200 mL i en 1 ml sprøyte. Fest en 26 gauge kanyle til toppen av sprøyten. </li><li> Bruk venstr...

<ol>
	<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages.">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li><li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+dendritic+cells,+macrophages,+and+epithelial+cells+in+the+gut:+implications+for+immune+tolerance.">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li><li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases.">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).</li><li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome.">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li><li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis.">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li><li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes:+perspectives+in+research+and+therapeutics.">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li><li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice.">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHIP-deficient,+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis.">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li><li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes.">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li><li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+mediated+depletion+of+macrophages:+mechanism+of+action,+preparation+of+liposomes+and+applications.">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li><li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism.">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li><li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues.">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li><li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization.">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation.">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li><li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation.">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li></ol>

Makrofager er phagocytic celler som spiller en viktig rolle i immunforsvaret. De er ansvarlige for å initiere det medfødte immunforsvaret og dirigerte ervervet immunrespons. Vanligvis er klassisk aktiveres makrofager aktiveres ved IFNγ eller LPS og er ansvarlig for å eliminere patogener og montering en betennelsesreaksjon en. Motsatt er alternativt aktiveres makrofager aktiveres ved IL-4 eller IL-13 og spiller en rolle i rusk scavenging og vev remodeling under oppløsningen av betennelse en. Sp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Klodronat som inneholder liposomer </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS som inneholder liposomer </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> Steril PBS pH7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Kalvefoster Serum (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> eddiksyre </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monothioglycerol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombinant murine MCSF </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Rekombinant murint GM-CSF </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Rekombinant murint IL-3 </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Rekombinant murine IFNγ </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Rekombinant murint IL-4 </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Cell Dissosiasjon Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Rat anti-F4/80 Antistoff </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Mus anti-Argi Antibody </td><td> BD transduksjon Laboratories </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Spesifikke reagenser som brukes i denne protokollen.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

Makrofager er kritiske aktører i det medfødte immunforsvaret mot infeksiøs utfordring eller skade, initiere det medfødte immunforsvaret og dirigerte ervervet immunrespons. Macrophage dysfunksjon kan føre til en manglende evne til å montere en hensiktsmessig immunrespons, og som sådan, har vært innblandet i mange sykdomsprosesser, inkludert inflammatoriske tarmsykdommer. Makrofager vise polariserte fenotyper som er grovt delt inn i to kategorier. Klassisk aktiverte makrofager, aktiveres ved stimulering med IFNγ eller LPS, spille en avgjørende rolle i respons til bakteriell utfordring mens alternativt aktiverte makrofager, aktiveres av IL-4 eller IL-13, delta i rusk scavenging og vev ombygging og har vært innblandet i oppløsning fasen av betennelse. Under en inflammatorisk respons in vivo, er makrofager funnet midt i en kompleks blanding av infiltrere immunceller og kan delta ved å forverre eller resolving betennelse. Å definere rollen makrofager in situ i en hel dyr modell, er det nødvendig å undersøke effekten av tappe makrofager fra komplekset miljøet. Å stille spørsmål om hvilken rolle macrophage fenotype in situ, kan fenotypisk definerte polariserte makrofager utledes ex vivo, fra benmargen aspirates og lagt tilbake til mus, med eller uten forutgående uttømming av makrofager. I protokollen som presenteres her klodronat-holdige liposomer, versus PBS injisert kontroller, ble brukt til å utarme colonic makrofager under dekstran natriumsulfat (DSS)-indusert kolitt i mus. I tillegg ble polarisert makrofager avledet ex vivo og overføres til mus ved intravenøs injeksjon. En påminnelse til denne tilnærmingen er at klodronat-holdige liposomer utarme alle profesjonelle fagocytter, inkludert både dendrittiske celler og makrofager, så for å sikre virkningen observert ved trykkavlastning er makrofag-spesifikk, rekonstituering of fenotype ved adoptiv overføring av makrofager er nødvendig. Systemisk macrophage uttømming i mus kan også oppnås ved tilbakekryssing mus på en CD11b-DTR bakgrunn, som er en utmerket komplementær tilnærming. Fordelen med klodronat-holdig liposome-mediert reduksjon er at den ikke krever tid og kostnader involvert i tilbakekryssing mus og den kan brukes i mus uavhengig av bakgrunn av mus (C57BL / 6, BALB / c, eller blandet bakgrunn ).

Watch this Scientific Journal Video about Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice at JoVE.com

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Makrofager spiller en sentral rolle i homeostase og patologi i mange vev. Protokollen som presenteres her beskriver metoder for å tappe makrofager<em&gt; In vivo</em&gt;, Avledet polariserte makrofager fra benmargen aspirates, og adoptively overføre makrofager i mus. Disse teknikkene tillater bestemmelse av rollen som polariserte makrofager spille i helse og sykdom.

Nedbryting og Rekonstituering av makrofager i Mus

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studier av Phagolysosome Biogenesis i Levende Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Proteomikk Profilering av Makrofager av 2D elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Nedbryting og dens effekt på Fagocytose av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifisering av cytosolisk vs. vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primær Makrofager av Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kvantifisering av monocytt chemotactic aktivitet in vivo og karakterisering av Blood monocytt avledet makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...