Name: high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
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Este trabalho foi financiado por um Projeto Wellcome Grant (078043/Z/05/Z) para ROJW

PARTE A: High-throughput crescimento de culturas bacterianas. 1. As bactérias crescem durante a noite, em 2 ml de Meio autoindução Usando placas de 24 poços <ol><li> Esterilizar as placas de 24 poços por microondas. </li><li> Inocular 1,5 ml de meio de auto-indução (Medium Overnight Express) com recém-cultivadas colônias de bactérias ou ações de glicerol congelados. Nós normalmente inocular três poços para cada mutante, com três colónias individuais clonados. Reservar seis poços para controlos positivos e negativos. Para os controlos positivos que crescem em três clones de tipo selvagem e para os controlos negativos que crescem dois clones que foram transformadas com um plasmídeo não expressar. Verificar para esterilização suficiente da placa, deixando uma cavidade em branco para o controlo do meio-only. </li><li> Cultivar as células durante 18 horas a 37 ° C e agitação a 250 rpm. Usamos lac induzível BL21 (DE3) Rosetta 2 células. Meio de auto-indução contém uma mistura de glucose e lactose. A bactéria inicialmentealimentar de glucose e em seguida começar a utilizar a lactose, o qual também induz a expressão das proteínas recombinantes. </li><li> Remover a tampa e colocar a placa na plataforma robótica. </li></ol> PARTE B: purificação de proteínas recombinantes Robótica. 2. Prepare a plataforma robótica <ol><li> Tornar-se o tampão de lavagem consistindo em 20 mM de imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glicerol a 10%, e o tampão de eluição constituído de imidazol 0,5 M, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% de glicerol. Estas memórias intermédias será usado para lavar as esferas após as proteínas marcadas foram ligados a eles, ou para eluir as proteínas a partir dos grânulos, respectivamente. </li><li> Tornar-se o diluente bacteriana (100 ml de água destilada, com 15 ul de reagente anti-espuma). Esta solução será usadapara fazer diluições das culturas bacterianas durante a noite para a densidade óptica (A600) medições. A presença de anti-espuma no diluente evita a formação de bolhas de ar que possam interferir com as medições de leitor de placa. </li><li> O volume da solução de lise composta por reagente fastbreak 10x, 2 lysonase ul por cada amostra e 15 mM MgOAc 2. Fastbreak contém uma mistura de detergentes e sais que quebrar as paredes celulares de bactérias e facilitar a liberação de proteínas intracelulares. Lysonase é uma mistura patenteada de lisozima e uma nuclease. Lisozima auxilia na ruptura da parede celular e a nuclease digere os ácidos nucleicos bacterianos libertados. </li><li> Opcional: Faça-se uma solução de cloridrato de 6 M de guanidina. Algumas proteínas recombinantes tendem a ficar com as agulhas com teflon de pipetagem. A guanidina desnatura as proteínas e solução de cloridrato de lava-los de forma mais eficaz do que a água que é rotineiramente usado para lavar as laváveis ​​robóticos dicas de pipetagem após cada ªep. </li><li> Prepare o BCA (ácido bicinconínico) reagente quantificação de proteínas por mistura de solução de ácido bicinconínico (reagente A) e da solução de sulfato de cobre (reagente B): ligações peptídicas reduzir Cu 2 + a partir do CuSO4 componente presente no reagente BCA de Cu em que 1 + a quantidade de Cu + 1 é proporcional ao número de ligações peptídicas presentes na solução. Num segundo passo, duas moléculas de ácido bicinconínico quelato de Cu 1 + resultando numa mudança de absorvância a 562 nm, o que resulta numa cor púrpura. A reação de cor é dependente do tempo e, geralmente, precisa de várias horas para ser definitiva. Depois que a cor é estável durante várias horas. </li><li> Preencha calhas ou placas do tamanho certo e colocá-los em suas posições pré-alocados na plataforma robótica. </li><li> Coloque uma placa de 24 cavidades para os resíduos de cloridrato de guanidina, duas claras placas de 96 cavidades para a OD 600 e medições de absorvância e um azul placa de 96 poços para poe proteínas purificadas sobre as suas posições sobre a plataforma. Coloque uma placa de 96 deepwell no stand magnético. </li><li> Diluir MagneHis Ni-partículas de proteínas que se ligam através da formação de quelatos com os seus His-Tag de 5 vezes em água destilada e enchê-los para a unidade de pérolas em agitação. Desligue o agitador para manter os grânulos em suspensão. </li><li> Ligue a plataforma robótica e lave as agulhas de pipetagem por vários minutos para remover as bolhas de ar que, de outra forma interferir com a precisão de pipetagem. As agulhas reutilizáveis ​​pipetagem são lavadas entre os passos de pipetagem individuais. Alternativamente, pontas descartáveis ​​podem ser utilizados. Todos os passos subsequentes são realizadas roboticamente. O protocolo de robótica está disponível mediante pedido. </li></ol> 3. Crescimento das células é verificada por medição da OD600 <ol><li> 10 ul da cultura durante a noite dilui-se em 90 ul de uma solução diluente. </li><li> Medir a OD 600 para assegurar que as bactérias cresceram até densidades semelhantes(Figura 1). </li></ol> 4. As células são quebradas para liberar as proteínas e para permitir Bead vinculativo <ol><li> 100 ul de suspensão de Ni-esfera magnética é distribuído em cada cavidade de uma placa de 24 cavidades segundo. </li><li> 900 uL de cada cultura em pequena escala bacteriano é transferido para a placa de 24 poços contendo os grânulos. Adicionar 100 ul da mistura fastbreak / lysonase 10x. </li><li> A placa de 24 poços é transferido para a plataforma de agitação para agitação rápida (800 rpm) durante 30 min à temperatura ambiente. As paredes das células bacterianas são interrompidas por uma combinação de forças mecânicas e acção química e as proteínas produzidas de forma recombinante são libertados para a solução. Com tags sua afinidade imediatamente ligar as esferas paramagnéticas de níquel quelantes. </li></ol> 5. As esferas são lavadas <ol><li> Os lisados ​​de células contendo-os grânulos em suspensão magnética são transferidos para uma placa de 96 deepwell que é posicionado sobre um suporte com mhastes agnetic que deslizam entre os poços. As placas de 96 cavidades têm uma parte inferior em forma de cone largo, que facilita a remoção do sobrenadante. As cavidades podem conter volumes de até 2,1 ml, mas são preenchidos com volumes muito pequenos. Isto permite-nos realizar vigorosos passos agitação sem amostra de contaminação cruzada por salpicos. </li><li> As pontas das pipetas são lavadas entre cada passos de pipetagem com 6 M de guanidina-HCl. Este passo é crucial para a depuração de TFIIB e outras proteínas &quot;pegajosos&quot;, para evitar a contaminação cruzada. Com outras proteínas pode ser suficiente para enxaguar as agulhas extensivamente com água, entre os passos de pipetagem. </li><li> As hastes magnéticas do suporte magnético atrair as esferas paramagnéticas, puxando-os para fora a partir dos centros dos poços e permitir que as agulhas de pipetagem livre acesso ao sobrenadante. O sobrenadante é descartado. </li><li> 500 ul de tampão de lavagem é adicionado à placa de 24 poços e subsequentemente transferido para a placa de 96 poços e paraNsure a transferência completa dos grânulos. A placa de 24 cavidades é removido do agitador. </li><li> Outra ul 500 de tampão de lavagem é adicionado directamente à placa de 96 poços, a placa foi transferida para o agitador e agitado vigorosamente durante 1 minuto. A placa é movida de volta para o suporte magnético e o tampão de lavagem descartada. </li><li> Este passo é repetido mais duas vezes e o procedimento de lavagem é terminada através da remoção de quaisquer vestígios de tampão da placa. </li></ol> 6. Eluir as proteínas em tampão de eluição <ol><li> 100 ul de tampão de eluição é adicionado aos grânulos, a placa é movida para o agitador e agitado vigorosamente durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> A placa é movida de volta para o agitador e o eluato contendo a proteína recombinante purificada, é transferida para uma nova placa. </li></ol> 7. Medir as concentrações das proteínas purificadas <ol><li> 190 ul de reagente BCA mistura é transferida para uma placa de 96 poços clara e 10 ul da protein solução adicionada. </li><li> Após várias horas de incubação (normalmente 5-6 ou durante a noite), medir a absorvância e compará-lo com os padrões de BSA para determinar as concentrações de cada uma das preparações de proteína purificada (Figura 2). </li><li> As proteínas purificadas podem agora ser usados ​​para aplicações a jusante, nas concentrações apropriadas (Figura 3). </li></ol> 8. Resultados representativos O protocolo de purificação oferece duas etapas de controlo de qualidade, exemplos dos quais são mostrados. Nós somos capazes de identificar e documentar os potenciais problemas na fase de crescimento bacteriano (Figura 1) e, mais tarde, mediante a avaliação dos rendimentos das proteínas purificadas (Figura 2). Nós normalmente purificar proteínas e testá-los em triplicado. Isto, em combinação com as duas etapas de controlo de qualidade, dá-nos a certeza de que qualquer variação foi observada nos nossos ensaios funcionais devem-se ao mutante phenotype (Figura 3) e não é causada por variações experimentais ou purificações falhadas. Os rendimentos obtidos variam tipicamente 50-200 ug e são mais do que suficientes para vários ensaios funcionais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Figura 1. Histograma das medições de OD de uma placa de 24 poços com culturas durante a noite. Três clones de seis TFIIB variantes mutantes, assim como do tipo selvagem TFIIB foram cultivadas. Dois clones que transportam um plasmídeo não expressar e um poço com meio apenas servem como controlos negativos. As medições de OD mostram que existem pequenas variações nas taxas de crescimento entre as diferentes culturas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Figura 2. Rendimentos proteicos obtidos a partir destas culturas, conforme determinado por um ensaio de BCA e confirmada por SDS-PAGE. Uma das variantes não é expresso em níveis elevados. Em comcombinação com a Figura 1, pode-se concluir que esta não era devida ao crescimento celular diferencial, mas, devido à expressão da proteína não ser induzido adequadamente. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Figura 3. Resultado representativo de um ensaio de transcrição. Medimos a actividade de estimulação de variantes TFIIB sobre a produção de pequenas transcritos abortivos por RNAP. Aqui, os efeitos de estimulação de uma biblioteca completa de substituições de um único aminoácido de TFIIB resíduo K87 são mostrados. O elevado grau de reprodutibilidade é confirmada por pequenas taxas de erro. Um gel de exemplo mostrando o desempenho de três mutantes em relação ao tipo selvagem (wt), controlos negativos (NC) e tampão de eluição apenas controla é descrito abaixo.

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de purificação da proteína recombinante automatizado aqui descrito permite a produção e purificação de um grande número de proteínas mutantes em um formato de pequena escala sob condições altamente reprodutíveis com uma intervenção humana mínima. Figuras 1 e 2 mostram os resultados dos controlos de qualidade-sistemáticos e exemplos do proteínas purificadas. Figura 3 mostra que os factores de transcrição purificados usados ​​neste exemplo realizar de uma maneira altamente reprodutíveis em ensaios funcionais. Mesmo que o processo foi desenvolvido para a purificação de arquea TFIIB, ele é amplamente aplicável para a purificação de proteínas marcadas com afinidade. A utilização de tais protocolos de purificação automatizados, assim, facilitar consideravelmente a análise bioquímica de proteínas recombinantes e, assim, ainda mais a nossa compreensão de interacções proteína-proteína em uma escala que é difícil de conseguir manualmente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Overnight Express Médio TB Instantânea </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71.491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak </td><td> Promega Ltd. </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente Lysonase Bioprocessing / 1 ml </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-Partículas </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Base Trizma </td><td> Sigma-Aldrich Compqualquer Ltd. </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Determinação de proteína do ácido bicinconínico Ácido </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Poço Profundo Placa 2,2 ml Praça Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca MicroWell 96 de poliestireno de fundo bem plana não tratada 12 mangas de cinco placas de 0,4 ml de volume bem claro 128 milímetros x 86 mm Thermo Scientific Nunc </td><td> Fisher Scientific Ltd. </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca Azul </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Bem RB blocos (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Agulha lavável para TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente para a cremalheira esferas magnéticas </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma robótica TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca Shaker Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços Tipo Um ímã </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

Cristalografia de raios X é o método de escolha para a obtenção de uma visão detalhada da estrutura das proteínas. Tais estudos devem ser complementadas por outras análises bioquímicas para obter insights detalhados em estrutura / função relacionamentos. Avanços no oligonucleótido e tecnologia de síntese de gene tornar estratégias de mutagénese em larga escala cada vez mais viável, incluindo a substituição de resíduos alvo por todos os outros 19 aminoácidos. Ganho ou perda de função de fenótipos então permitir conclusões sistemáticas para ser elaborados, tais como a contribuição dos resíduos específicos a actividade catalítica a estabilidade da proteína, e / ou proteína-proteína especificidade interacção. De modo a atribuir diferentes fenótipos à natureza da mutação -, em vez de a variação das condições experimentais, - é vital para purificar e analisar as proteínas de uma forma controlada e reprodutível. Alto rendimento estratégias ea automação de protocolos manuais emrobóticos líquido de manipulação de plataformas criaram oportunidades para realizar tais procedimentos complexos moleculares biológicos com pouca intervenção humana e as taxas de erro mínimo de 1-5. Aqui, nós apresentamos um método geral para a purificação da His-tag proteínas recombinantes de um modo de alto rendimento. Num estudo recente, foi aplicado o método de uma investigação detalhada estrutura-função de TFIIB, um componente da maquinaria de transcrição basal. TFIIB é indispensável para o promotor da transcrição dirigida in vitro e é essencial para o recrutamento de polimerase de ARN em um complexo de pré-iniciação 6-8. TFIIB contém um domínio de ligação flexível que penetra na fenda do local activo da polimerase de ARN 9-11. Este domínio ligante confere dois bioquimicamente actividades quantificáveis ​​em TFIIB, a saber, (i) a estimulação da actividade catalítica durante a fase de &#39;abortivo&#39; de iniciação transcrição, e (ii) uma contribuição adicional para orecrutamento específica da polimerase de RNA para o pré-iniciação complexo 4,5,12. Nós explorada o método de purificação de alto rendimento para gerar substituição única, dupla e tripla e mutações deleções dentro do linker TFIIB e para posteriormente analisá-las em ensaios funcionais para o seu efeito de estimulação sobre a actividade catalítica da RNA polimerase 4. Ao todo, foram geradas, purificados e analisados ​​381 mutantes - uma tarefa que teria sido demorada e trabalhosa para executar manualmente. Nós produzimos e ensaiadas as proteínas em multiplicates que nos permitiu apreciar quaisquer variações experimentais e nos deu uma idéia clara da reprodutibilidade dos nossos resultados. Este método serve como um protocolo genérico para a purificação de proteínas marcadas com His-e tem sido utilizado com sucesso para purificar outras proteínas recombinantes. Actualmente, é optimizada para a purificação de proteínas de 24, mas pode ser adaptado para purificar até 96 proteínas.

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High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

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