Name: solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Zachary Z. Brown og Jennifer Alleva for den indledende udvikling af denne fastfasesyntesen teknik og Matthew FL Parker for nyttige diskussioner. Dette arbejde understøttes af Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) og Horst Witzel Fellowship Award støttes af Cephalon, Inc.

1. Opsætning <ol><li> Reaktionsblandingen set-up for fast-fase syntese er en polypropylen filterpatron eller glasreaktor, der er forbundet via polypropylen rør til en lukket filtrering kolbe under vakuum, som vist i figur 1. Reaktionen kan blandes med en magnetisk omrørerstav eller ved at boble nitrogen gennem reaktoren. </li><li> En gas-manifolden forbundet til en Argon cylinder forsynet med et tørrerør og oliebobler anbefales også, da det tillader reaktionsbeholderen, der skal indeholdes under en inert atmosfære og tillader fjernelse af reagenser fra forseglede beholdere. </li><li> Alle operationer udføres i et stinkskab og korrekt personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, laboratoriekittel og nitril handsker) er påkrævet. </li></ol> 2. Lastning første bis-peptid på Resin <ol><li> Afvej 114 mg HMBA-AM-harpiks (0,88 mmol / g påføring, 100 pmol) i 8 ml reaktionsbeholder, og der tilsættes magnetisk omrørerstav. Sæt låg på toppen af ​​the fartøj med en gummiskillevæg, og udskillelse af røret med argon i mindst 5 minutter. </li><li> I mellemtiden vejer 117,3 mg af forbindelse 1 i figur 3 (586,63 g / mol, 2 ækv) og 59,2 mg 1 - (mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296,0 g / mol, 2 ækv) i en 15 ml engangs centrifugerør og opløses i 2 ml vandfri dichlormethan (DCM). Tilsættes 24 pi 1-methylimidazol (NMI, 80,81 ml / mol, 3 ækv) til opløsningen og blandes indtil det er fuldstændigt opløst. </li><li> Overfør den aktiverede opløsning til reaktionsbeholderen via sprøjte, og der omrøres under argon natten over (ca. 10 timer). </li><li> Fjerne septum og dræne reaktionsblandingen. Resinen vaskes med DCM (5x) og dimethylformamid (DMF) (5x). Udfør &quot;methylrødt test&quot; beskrevet i afsnit 10,1 for at vurdere graden af ​​harpiks belastning. Hvis harpiksen forbliver rødt under methylrødt testen derefter trin 2,2 og 2,3 bør gentages. En gul farve, der indikerer et negativt methylrødt test, er foretrukne;kan dog idet eventuelle resterende hydroxylgrupper vil blive udjævnet i næste trin, et svagt positivt resultat (lys orange harpiks farve) være acceptabel. </li></ol> 3. Afbeskyttelse af første bis-peptid og samtidig Resin Loft <ol><li> Tilsæt 1 ml af DCM til reaktionsbeholderen derefter tilsættes 1 ml 33% hydrogenbromid i eddikesyre i løbet af 30 sekunder (boblende forekommer) og omrøres i 15 minutter. Tøm og vask harpiksen med DCM (5x) og gentag processen en gang mere. </li><li> Resinen vaskes med DCM (5x), derefter DMF (5x). Neutralisere den harpiksen ved vask to gange med en 5% volumen / volumen opløsning af N, N-diisopropylethylamin (DIPEA) i DMF, hvorefter der vaskes med DCM (5x) og DMF (5x) igen. Udfør &quot;methylrødt test&quot; og &quot;chloranil test&quot; diskuteret i afsnit 10,1 og 10,2. Resultaterne skulle være negativ for methylrødt testen og positiv for chloranil test. </li></ol> 4. Kobling Boc / tBu-beskyttet funktionaliserede Bis-AmiIngen syreproduktion <ol><li> Genindføre en inert atmosfære til harpiks-holdige reaktionsbeholder ved vask tre gange med vandfrit DCM derefter fastgøre et septum og argon linie. Rense og vask beholderen ved tilsætning 1-2 ml vandfri DCM og lade blandingen omrøres i 30 sekunder og derefter dræner beholderen, indtil argon linie absorptionskolben begynder at stige. Gør dette mindst en gang mere. </li><li> Fremstille en opløsning af 0,15 M funktionaliseret bis-aminosyre (3 ækv) og 245 mg 1-hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) i 2 ml 2:1 DCM: DMF i en flammetørret test Røret under argonatmosfære. Tilsættes 47 uL af diisopropylcarbodiimid (DIC, 156,6 ml / mol, 3 ækv), og blandingen omrøres i 90 minutter. </li><li> Tilsættes 35 uL DIPEA (174,19 ml / mol, 2 ækv) i 666 ul vandfrit DMF til harpiksen, og der omrøres i 5 minutter. </li><li> Overføre præ-aktiverede bis-aminosyre-opløsning til reaktionsbeholderen via sprøjte, og der omrøres natten over. </li><li> Dræne reaktionsblandingen og vaskes to gange med vandfrit DCM under under<html> argon. </li><li> At fremme lukning af diketopiperazin, tilsættes en 0,25 M opløsning af HOAt (136,11 g / mol, 10eq) og DIC (156,6 ml / mol, 10eq) i en 4 ml af 1:1 DCM: DMF og omrøres under argon i 1 time. </li><li> Fjerne septum og dræne reaktionsblandingen. Resinen vaskes med DCM (5x) og DMF (5x). Hvis det ønskes, udføre &quot;chloranil test&quot; omtalt i afsnit 10,2. </li></ol> 5. Afbeskyttelse af Boc / tBu-beskyttet funktionaliseret Bis-Amino Acid <ol><li> Tilsæt 2 ml af en opløsning af 95:5 trifluororacetic syre (TFA): triisopropylsilan (TIPS) til reaktionsbeholderen, og gør det muligt at omrøre i 1 time. Drænes og vaskes harpiksen i 30 sekunder med DCM (5x), derefter gentage processen igen. </li><li> Resinen vaskes med DCM (5x), derefter DMF (5x). Neutralisere den harpiksen ved vask to gange med en 5% volumen / volumen opløsning af DIPEA i DMF og derefter vaske DCM (5x) og DMF (5x) igen. Hvis det ønskes, udføre &quot;chloranil test&quot; omtalt i afsnit 10,2. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Gentag trin 4 og 5, som ønskede at syntetisere målrettede bis-peptid. 7. Funktionalisere Bis-peptid Prolidine End <ol><li> Den prolidine ende af det voksende bis-peptid kan acyleres uafhængigt eller sammen gennem en diketopiperazin. Desuden kan denne forbindelse efterlades beskyttes, som vil blive spaltet sidstnævnte giver den frie aminosyre. Hvis det ønskes, udføre &quot;chloranil test&quot; diskuteret i afsnit 10,2 for at vurdere kobling effektivitet. </li></ol> 8. Afbeskyttelse af Fmoc og acylering af kvartære End af bis-peptid <ol><li> En 2 ml opløsning af 20% piperidin i DMF tilsættes, og reaktionsblandingen blandes i 20 minutter. Tøm og vask harpiksen med DMF (5x) gentag processen en gang mere. </li><li> Resinen vaskes med DCM (5x), derefter DMF (5x). </li><li> Fremstilling af en 0,15 M opløsning af aminosyre (3 ækv) i 2 ml N-methylpyrrolidon (NMP) med 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3 ækv) og 104,5 ul DIPEA (174,19 ml / mol, 6eq) og bland godt. Tilsættes til reaktionsbeholderen, og der omrøres i 6 timer. </li><li> Resinen vaskes med DCM (5x), derefter DMF (5x). </li></ol> 9. Fjerne Boc-gruppen fra det harpiksbundne aminosyre og spaltes fra harpiks <ol><li> Tilsæt 2 ml af en 1:1 TFA: DCM-opløsning til reaktionsbeholderen, og der omrøres i 30 minutter. Tøm og vask harpiksen med DCM (5x) og gentag processen en gang mere. </li><li> Vaske og tømme harpiksen i 30 sekunder med DCM (5x), derefter DMF (5x). </li><li> Tilsæt 2 ml af en opløsning af 10% DIPEA i vandfrit DMF og omrøres 24-48 timer. </li><li> Samle reaktionsblandingen i tarerede rundbundet kolbe. Overføre 30 ul af denne opløsning til 450 pi THF i en LC-MS hætteglas og sende til analyse. Resinen vaskes med yderligere portioner af DMF og opsamles i den rundbundede kolbe og derefter fjerne opløsningsmidlet i vakuum. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Oprensning af Bis-peptid <ol><li> Opløs rå bis-peptid i en minimal mængde dimethylsulfoxid (100-250 pi) og overføres til HPLC hætteglas insert. Sted insertet i autosampleren delvis prepitive HPLC-system (Hewlett Packard 1100 Series) udstyret med en XTERRA Prep MS C18 5 um 7.8x150 mm søjle og en 100 pi injektionssløjfe. </li><li> Udføre flere 50 ul injektioner af prøven under anvendelse af en gradient program på 5-95% acetonitril i vand med 0,1% myresyre i løbet af 30 minutter under overvågning ved 274 nm. Opsaml produktet top i en forvejet engangs centrifugerør og fryse tør bruge en frysetørringsapparat. Der skal udvises forsigtighed med det første løb som en lille forskydning i toppen retentionstiden forhold til analytiske LCMS typisk observeres. </li></ol> 11. Vurderingsmetoder <ol><li> Methylrødt TEST 7: Fjernes ~ 1 mg tør harpiks via engangspipette og skylles i 4 ml reaktionsbeholder. Tilsættes en opløsning af 20 mg methyl-rødt, 50 ul N, N&#39;-diisopropylcarbodiimid (DIC) og 5 mg 4-dimethylaminopyridin (DMAP) i 500 ul vandfrit DCM og omrøres i 5-10 minutter. Drænes og vaskes harpiksen med DCM, indtil filtratet bliver farveløst. Positiv indikation er harpiksperlerne resterende orange eller rød. </li><li> Chloranil TEST 12: Transfer ~ 1 mg tør harpiks i et lille hætteglas via engangspipette. Tilsættes 3 dråber af både 0,8 mM chloranil i DMF-opløsning og 2% acetaldehyd i DMF-opløsning, og lad stå ved stuetemperatur i 5-10 minutter. Positiv indikation er harpiksperlerne dreje blå / lilla. </li><li> AKTIVERING TRAP TEST: Aktiverede forbindelser under syntesen kan vurderes ved at overføre en lille mængde (5-10 pi) af den aktiverede opløsning til en væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) hætteglas indeholdende 50 pi pyrrolidin. Blandes med håndkraft i nogle få sekunder (løsninden bør blive gul) fortynd dernæst med 450 ul af tetrahydrofuran (THF) og indsende til LC-MS-analyse. </li><li> ANALYTISK LC-MS: Det endelige produkt og aktiverede mellemprodukter kan vurderes under anvendelse af en HP 1200-serien LC-MS-system udstyret med en Waters XTERRA MS C18 3,5 um 4,6 mm x 150 mm kolonne og et gradientsystem af 5-95% acetonitril i vand med 0,1% myresyre i 30 minutter. </li></ol> 12. Repræsentative resultater Et eksempel på både rå (fig. 4) og oprenset (fig. 5) LCMS spor er tilvejebragt. Oprensede udbytter på 10% forventes ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet ovenfor. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figur 1. Diagram over forsøgsopstilling til fastfasesyntese. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figur 2.Relevant nomenklatur Bis-aminosyrer / BIS-peptider. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figur 3. Samlet synteseskema. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figur 4a. HPLC spor af råproduktet ved 274 nm. <img alt="Figur 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figur 4b. MS-spektrum råprodukt Peak. <img alt="Figur 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figur 5a. HPLC spor af oprenset produkt ved 274 nm. <img alt="Figur 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figur 5b. MS spektrum af oprenset ProductionTpeak.

<ol>
	<li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (1989).</li><li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides.">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li><li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-Programmable+Macromolecules.">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li><li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids.">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li><li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues.">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li><li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports.">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li><li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis.">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li><li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation.">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li><li>Plas, S. E. V. a. n. d. e. r., Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs:+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC.">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li><li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides.">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li><li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase.">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Den syntetiske fremgangsmåde er præsenteret heri tilvejebringer en fremgangsmåde til syntese af funktionaliserede bis-peptider fra bis-aminosyre byggeblokke anvender fælles fastfase-peptidsynteseteknikker. Den monomer syntese af disse &quot;Pro4&quot; byggeklodser fra trans-4-hydroxyprolin 3 er meget skalerbar og er blevet afsluttet til hydantoin scenen på en 600 mmol (234 g) skala (ikke offentliggjort). Når de monomerer er i hånden, anvendelse af fastfase-teknikker tilvejebringer en hurtigere metode til bis-peptidsyntese end vores nuværende opløsning-fase metode 4 ved at eliminere behovet for reaktionen arbejde op-og mellemliggende oprensninger. Den primære udfordring i fast-fase syntese diagnosticere syntetisk fremskridt og problemløsning da ingen mellemprodukter isoleres. Dette har ført til udviklingen af mange kolorimetriske tests, herunder dem, der angiver, om frie aminer (Kaiser test 10) eller frit hydroxyls (methylrødt Test 7) udsættes for harpiks. Uheldigvis er almindeligt anvendte Kaiser-test 10 er generelt ikke anvendes i vores fastfasesyntese på grund af den næsten udelukkende anvendelse af sekundære aminer eller aminer bundet til et kvaternært carbonatom. Andre muligheder for vurdering af HMBA harpiks indbefatter test skel ved hjælp af en nukleofil, såsom hydrazin 11, kvantitativ Fmoc spaltning overvåges af UV / Vis 1,11, og indfangning og analysere indkommende aktiverede forbindelser. Et andet overset problem i fast-fase syntese er den repetitive natur af syntetiske trin, der kræves af brugeren. Med dette in mente, forfatterne anbefaler brug af et regneark eller en tjekliste, når du udfører en manuel fast-fase-peptidsyntese. Den vanskeligt at bruge bis-peptider til fast-fase syntese sammenlignet med almindelige α-aminosyrer omfatter potentialet for mere vanskeligt koblinger på grund af sterisk hindrance, behovet for on-harpiks diketopiperazin lukninger, og samtidige afbeskyttelser (Boc / tBu; Cbz / tBu). Anden vanskeligt ligger opnå kvantitativ afgivelse fra harpiksen ved anvendelse af denne &quot;sikkerhedslåsen&quot;-metoden i sammenligning med mere konventionelle midler. Med disse faktorer in mente, er det meget muligt, at yderligere optimering af denne metode kan opnås, og den nuværende indsats er i gang i vores gruppe for at forbedre den metode, der præsenteres her.

<table border="1"><tr><td> Navn </td><td> Firma </td><td> Katalognr </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resin </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Giftig, Ætsende </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Kræftfremkaldende </td></tr><tr><td> Vandfri DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Kræftfremkaldende </td></tr><tr><td> 33% hydrogenbromid i eddikesyre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Giftig, Corrosive, Dampe når den er åben </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Brandfarlige, giftige, ætsende </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Brandfarlige, giftige </td></tr><tr><td> Vandfrit DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Brandfarlige, giftige </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Brandfarlige, giftige, ætsende </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Giftig, Ætsende </td></tr><tr><td> TIPS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Brandfarlige, giftige </td></tr><tr><td> Piperidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Brandfarlige, giftige, ætsende </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Giftig </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> Methylrødt </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Brandfarlige, giftige, Peroxide Forming </td></tr><tr><td> Pyrrolidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Brandfarlige, giftige, ætsende </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Fisher </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS Reaktionstanke </td><td> Grace </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Series </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100 Series </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Lyophiliseringsapparat </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 serien </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

I 1962, publiceret RB Merrifield den første procedure under anvendelse af fast-fase peptidsyntese som en hidtil ukendt vej til effektivt syntetisere peptider. Denne teknik hurtigt bevist fordelagtigt i forhold til dets løsning-fase forgænger i både tid og arbejdskraft. Forbedringer vedrørende arten af ​​fast støtte, de beskyttende grupper ansat og koblingen anvendte metoder i løbet af de sidste fem årtier har kun øget nytten af ​​Merrifield oprindelige system. Dag, anvendelse af en Boc-baseret beskyttelse og base / nukleofil fraspaltelig harpiks strategi eller Fmoc beskyttelses-og sure spaltelig harpiks strategi udviklet af RC Sheppard, der mest almindeligt anvendes til syntese af peptider 1. Inspireret af Merrifield solide understøttet strategi har vi udviklet en Boc / tert-butyl fastfasesyntese strategi for samling af funktionaliserede bis-peptider 2, som er beskrevet heri. Anvendelse af fast-fase syntese sammenlignet to opløsning-fase metode er ikke blot fordelagtigt i tid og arbejdskraft, som beskrevet af Merrifield 1, men tillader også større lethed ved syntese af bis-peptidbiblioteker. Syntesen at Vi viser her omfatter en afsluttende spaltning trin, der anvender en totrins-&quot;sikkerheds&quot;-mekanisme for at frigive den funktionaliserede bis-peptidet fra harpiksen ved diketopiperazin-dannelse. Bis-peptider er stive, spiro-ladder oligomerer af bis-aminosyrer, der er i stand til at positionere funktionalitet i en forudsigelig og designable måde, der kontrolleres af typen og stereokemien af ​​de monomere enheder, og forbindelsen mellem hver monomer. Hver bis-aminosyre er en stereokemisk ren cyklisk skelet, der indeholder to aminosyrer (en carboxylsyre med en α-amin) 3,4. Vores laboratorium øjeblikket undersøge potentialet af funktionelle bis-peptider på tværs af en lang række områder, herunder katalyse og protein-protein interaktioner og nanomaterials.

Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Den effektive fastfase-peptidsyntese af en funktionaliseret bis-peptid trimer anvendelse af en &quot;sikkerheds&quot;-spaltning proceduren fra HMBA harpiks er beskrevet.

Fastfase-syntese af en funktionaliseret Bis-peptid ved anvendelse af &quot;sikkerheds&quot; Metode

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Research

JoVE Journal

Biology

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler til at studere protein-protein interaktion: poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Introduktion til faste bårne Membranbaseret Elektrofysiologi

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Syntese af bølgelængden-shifting DNA hybridiseringsprober ved hjælp fotostabile cyaninfarvestoffer

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Tør Root Rot Disease Assays i kikært: en detaljeret metode

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Funktionaliseret spirosyklisk heterocyklussyntese og cytotoksicitetsanalyse

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering og analyse af sporbare og funktionaliserede ekstracellulære vesikler fra plasma og fast væv

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Bestemmelse af S-fase varighed ved anvendelse af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin inkorporering i Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...