Name: solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר זכריה ז בראון וג&#39;ניפר Alleva לפיתוח הראשוני של טכניקה זו סינתזה מוצק בשלב פרקר ומתיו FL לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי הסוכנות איום הפחתת ההגנה (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) ואת פרס Witzel הורסט אחוות נתמך על ידי Cephalon, Inc

1. הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה הגדרת לסינתזה מוצק בשלב זה מחסנית פוליפרופילן פילטר או הכור זכוכית המחוברת דרך צינור פוליפרופילן בקבוק סינון סגורה תחת ואקום, כפי שמוצג באיור 1. התגובה יכולה להיות מעורב בר סערה מגנטית או מבעבעים חנקן באמצעות כור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעפת הגז המחובר גליל ארגון מצויד בצינור ייבוש bubbler שמן מומלץ גם היא מאפשרת את כלי התגובה להיכלל תחת אווירה פעיל ולא מאפשר הסרה של חומרים כימיים מ באריזות סגורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הפעולות נעשות במנדף ונכון ציוד מגן אישי (משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות nitrile) נדרשת. </li></ol> 2. ראשית טוען Bis-peptide על גבי שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 114 מ&quot;ג HMBA-AM שרף (0.88 mmol / טעינה גרם, 100 μmol) לכלי 8 תגובה מ&quot;ל ולהוסיף בר סערה מגנטית. מכסה את החלק העליון של הדואר עם כלי מחצה גומי טיהור צינור עם ארגון לפחות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, שוקל 117.3 מ&quot;ג של מתחם 1 של איור 3 (586.63 g / mol, 2eq) ו - 59.2 מ&quot;ג של 1 - (mesitylene-2-sulfonyl)-3-Nitro-1-,2,4 triazole (MSNT, 296.0 g / mol, 2eq) לתוך צינור 15 צנטריפוגות הפנויה מ&quot;ל ו להתמוסס dichloromethane מ&quot;ל 2 נטול מים (DCM). הוסף 24 μL של 1-methylimidazole (NMI, 80.81 מ&quot;ל / mol, 3eq) לפתרון ומערבבים עד שהיא נמסה לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון מופעל לכלי התגובה באמצעות מזרק ולאפשר לעורר תחת ארגון לילה ~~~HEAD=NNS (10 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחיצת ומסננים את התערובת התגובה. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו dimethylformamide (DMF) (5x). לבצע את &quot;מבחן מתיל אדום&quot; המתואר בסעיף 10.1 כדי להעריך את מידת הטעינה שרף. אם שרף נשאר אדום במהלך הבדיקה מתיל אדום ואז צעדים 2.2 ו 2.3 יש לחזור. צבע צהוב, מצביע על מבחן שלילי מתיל אדום, היא המועדפת;עם זאת, מאז באף אחת מהקבוצות הידרוקסיל הנותרים יהיו כתרים בשלב הבא, תוצאה חיובית מעט (אור בצבע כתום שרף) עשוי להיות מקובל. </li></ol> 3. Deprotection של שרף Bis-peptide בו זמנית ראשון תקרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של DCM לכלי התגובה ולאחר מכן להוסיף 1 ברומיד מ&quot;ל מימן 33% dropwise חומצה אצטית על 30 שניות (מבעבע מתרחשת) ולאפשר לעורר במשך 15 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). לנטרל את שרף על ידי שטיפה פעמיים עם פתרון V / V 5% N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) ב DMF מכן לשטוף עם DCM (5x) ו DMF (5x) שוב. לבצע את &quot;מבחן מתיל אדום&quot; ו - &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.1 ו -10.2. תוצאות צריך להיות שלילי אדום מתיל הבדיקה חיובית למבחן chloranil. </li></ol> 4. צימוד BOC / tBu מוגן פונקציונליות Bis-עמילא חומצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר אווירה אינרטי לכלי, המכיל שרף תגובה על ידי שטיפה שלוש פעמים עם DCM נטול מים מכן לצרף מחצה וקו ארגון. לנקות ולשטוף את הכלי על ידי הוספת 1-2 מ&quot;ל של DCM נטול מים ולתת ומערבבים במשך 30 שניות ולאחר מכן ניקוז כלי עד קו ארגון bubbler מתחיל לעלות. האם זה לפחות עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה של 0.15 M פונקציונליות BIS-חומצת אמינו (3eq) ו - 245 מ&quot;ג של 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt, 136.11 g / mol, 18eq) ב 2 מ&quot;ל של DCM 02:01: DMF במבחן האש יבשים צינור תחת אווירה ארגון. הוסף 47 μL של diisopropylcarbodiimide (DIC, 156.6 מ&quot;ל / mol, 3eq) ומערבבים במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 35 DIPEA μL (174.19 מ&quot;ל / mol, 2eq) ב DMF 666 נטול מים μL כדי שרף ומאפשרים לערבב במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר מראש פעיל BIS-חומצה אמינית פתרון לכלי התגובה באמצעות מזרק ולאפשר לעורר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את התערובת התגובה ולשטוף פעמיים עם DCM נטול מים בתקופת<html> ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקדם את סגירת diketopiperazine, להוסיף פתרון 0.25 מ &#39;של HOAt (136.11 g / mol, 10eq) ו DIC (156.6 מ&quot;ל / mol, 10eq) ב 4 מ&quot;ל של 1:1 DCM: DMF ולאפשר לעורר במסגרת ארגון שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחיצת ומסננים את התערובת התגובה. לשטוף את שרף עם DCM (5x) ו DMF (5x). אם תרצה, לבצע את &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.2. </li></ol> 5. Deprotection של BOC / tBu מוגן חומצה אמינו Bis-פונקציונליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תמיסה של חומצה trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropylsilane (TIPS) לכלי התגובה ולאפשר לו ומערבבים במשך שעה 1. מסננים שוטפים את שרף במשך כ 30 שניות עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). לנטרל את שרף על ידי שטיפה פעמיים עם פתרון V / V 5% DIPEA ב DMF אז לשטוף DCM (5x) ו DMF (5x) שוב. אם תרצה, לבצע את &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.2. </li></ol>לה טמפ &quot;&gt; 6. חזור על שלבים 4 ו -5 לפי הצורך לסנתז ממוקד BIS-peptide. 7. Functionalizing סוף Bis-peptide Prolidine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף prolidine של פפטיד BIS הגוברת ניתן acylated באופן עצמאי או יחד באמצעות diketopiperazine. כמו כן, לצורך כך ניתן להשאיר מוגנים, אשר יהיה ביקע האחרונים והנותן את חומצת האמינו חינם. אם תרצה, לבצע את &quot;מבחן chloranil&quot; שהוזכר בסעיף 10.2 כדי להעריך את יעילות צימוד. </li></ol> 8. Deprotection של Fmoc ו Acylation הסוף הרביעון של Bis-peptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2ml של piperidine 20% DMF נוסף והתגובה היא מעורבת במשך 20 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DMF (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.15 מ &#39;של חומצת אמינו (3eq) ב 2 מ&quot;ל של N-methylpyrrolidone (NMP) עם 114 מ&quot;ג 2 - (7-עזה-1H-benzotriazole-1-י.ל.) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate<html> (HATU, 380.2 גרם / מול, 3eq) ו 104.5 DIPEA μL (174.19 מ&quot;ל / mol, 6eq) ומערבבים היטב. הוסף תגובה כלי ולאפשר לעורר במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שרף עם DCM (5x) ואז DMF (5x). </li></ol> 9. הסר את הקבוצה BOC שרף כרוך חומצת אמינו ו קליב שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של TFA 01:01: פתרון DCM לכלי התגובה ולאפשר לעורר במשך 30 דקות. מסננים שוטפים את שרף עם DCM (5x) ולאחר מכן חזור על התהליך פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולנקז שרף במשך 30 שניות עם DCM (5x) ואז DMF (5x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תמיסה של DIPEA 10% DMF נטול מים ולאפשר לעורר 24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התערובת לתוך בקבוק התגובה מראש שקל בתחתית הסיבוב. העברת 30 μL של פתרון זה μL 450 של THF בבקבוקון LC-MS ולהגיש לבדיקה. לשטוף את שרף עם aliquots נוספים של DMF ולאסוף לתוך הבקבוק התחתון בסיבוב מכן הסר ממס ב vacuo. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. טיהור של ה-BIS-peptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים גולמי BIS-peptide בסכום מינימלי של sulfoxide דימתיל (100-250 μL) ולהעביר את הכנס בקבוקון HPLC. הכנס לתוך המקום autosampler של חצי prepitive HPLC המערכת (Hewlett Packard 1100 הסדרה) מצויד הכנה XTerra MS טור C18 7.8x150 5 מ&quot;מ מיקרומטר ו לולאה 100 הזרקת μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע מספר רב של 50 זריקות μL של המדגם באמצעות תוכנית הדרגתי של 5-95% אצטוניטריל במים עם חומצה פורמית 0.1% מעל 30 דקות תוך ניטור ב 274 ננומטר. איסוף המוצר שיא בצינור מראש שקל חד פעמי צנטריפוגות ולהקפיא יבש באמצעות lyophilizer. זהירות יש לנקוט עם הסיבוב הראשון כמו שינוי קל זמן השמירה שיא בהשוואה LCMS אנליטיים הוא נצפה בדרך כלל. </li></ol> 11. שיטות הערכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיל אדום מבחן 7: הסר ~ 1 מ&quot;ג של שרף יבש באמצעות פיפטה חד פעמי לשטוף את כלי התגובה 4 מ&quot;ל. הוסף פתרון של 20 מ&quot;ג מתיל אדום, 50 N μL, ללהקת diisopropylcarbodiimide (DIC), ו 5 מ&quot;ג 4-dimethylaminopyridine (DMAP) ב DCM 500 נטול מים μL ולאפשר לעורר למשך 5-10 דקות. מסננים לשטוף שרף עם DCM עד תסנין הופך חסר צבע. סימן חיובי הוא שרף את החרוזים הנותרים כתום או אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן CHLORANIL 12: העברה ~ 1 מ&quot;ג של שרף יבש לתוך בקבוקון קטן באמצעות פיפטה חד פעמי. הוסף 3 טיפות של chloranil הן 0.8 מ&quot;מ פתרון DMF ו אצטילדהיד 2% בתמיסה DMF ולתת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות. אינדיקציה חיובית היא החרוזים שרף מפנה כחול / סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלכודת הפעלת מבחן: תרכובות מופעל במהלך הסינתזה ניתן להעריך על ידי העברת כמות קטנה (μL 5-10) של הפתרון מופעל על כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה נוזלית (LC-MS) בקבוקון המכיל 50 μL של pyrrolidine. מערבבים ביד במשך כמה שניות (solutiב צריך להיות צהוב) ואז לדלל עם μL 450 של tetrahydrofuran (THF) ולהגיש לניתוח LC-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנליטי LC-MS: המוצר הסופי ביניים הפעיל ניתן להעריך באמצעות HP 1200 סדרת LC-MS מערכת מצויד Xterra ווטרס טרשת נפוצה 3.5 מיקרומטר C18 4.6 מ&quot;מ x 150 מ&quot;מ טור מערכת שיפוע של אצטוניטריל 5-95% במים עם חומצה פורמית 0.1% מעל 30 דקות. </li></ol> 12. נציג תוצאות דוגמה בוטה הן (איור 4) מטוהרים (איור 5) עקבות LCMS מסופקים. התשואות מטוהרים של כ -10% צפויים להשתמש בשיטות שתוארו לעיל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים של ניסיוני הגדרת לסינתזה שלב מוצק. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> איור 2.מינוח רלוונטי של ה-BIS, חומצות אמינו / כתם למוצרי פפטידים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> איור 3. תוכנית סינטטי בסך הכל. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <img alt="איור 4 א" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> איור 4 א. Trace HPLC של מוצר גולמי ב 274 ננומטר. <img alt="איור 4 ב &#39;" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> איור 4 ב &#39;. ספקטרום MS שיא של מוצר גולמי. <img alt="איור 5 א" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> איור 5 א. HPLC עקבות של מטוהרים מוצר ב 274 ננומטר. <img alt="איור 5 ב &#39;" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> איור 5 ב &#39;. MS ספקטרום של מטוהרים producלא שיא.

<ol>
	<li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (1989).</li><li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides.">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li><li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-Programmable+Macromolecules.">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li><li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids.">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li><li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues.">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li><li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports.">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li><li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis.">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li><li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation.">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li><li>Plas, S. E. V. a. n. d. e. r., Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs:+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC.">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li><li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides.">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li><li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase.">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הגישה המוצגת כאן סינתטי מספק שיטה לסינתזה של פפטידים למוצרי כתם פונקציונליות מ-BIS אמינו אבני הבניין של חומצות באמצעות נפוצות מוצק שלב סינתזה טכניקות פפטיד. סינתזה מונומר אלה אבני הבניין &quot;Pro4&quot; מ 3 טרנס-4-hydroxyproline היא מדרגית הושלם בהצלחה השלב hydantoin ב mmol 600 (234 גרם) בהיקף (לא פורסם). לאחר מונומרים הם ביד, השימוש מוצק שלב טכניקות מספק שיטה מהירה יותר של סינתזה BIS-peptide מ המתודולוגיה הנוכחית פתרון שלב 4 שלנו על ידי ביטול הצורך התגובה עבודה עליות purifications ביניים. האתגר העיקרי בסינתזה מוצק הוא שלב באבחון התקדמות הבעיה סינתטי פתרון ביניים שכן אין הם מבודדים. זה הוביל לפיתוח של בדיקות colorimetric רבים כולל אלה כדי לזהות אם אמינים חינם (קייזר מבחן 10) או ללא hydroxyls (מתיל מבחן האדום 7) נחשפים על שרף. למרבה הצער, מבחן נפוץ קייזר 10 אינו חל בדרך כלל סינתזה שלנו מוצק שלב עקב השימוש הבלעדי כמעט של אמינים או אמינים משניים המחובר לפחמן הרביעון. אפשרויות אחרות להערכה על שרף HMBA כוללים השסעים הבדיקה באמצעות nucleophile כגון 11 הידרזין, מחשוף Fmoc כמותית פיקוח על ידי UV / Vis 1,11, ו - השמנה וניתוח תרכובות מופעל נכנסות. נושא נוסף התעלמו בסינתזה מוצק בשלב זה האופי החוזר ונשנה של צעדים סינתטיים הנדרשים על ידי המפעיל. עם זה בחשבון, החוקרים ממליצים על שימוש בגיליון אלקטרוני או רשימת הבדיקה בעת ביצוע כל סינתזה ידנית מוצק בשלב פפטיד. המתקשים בשימוש כתם למוצרי פפטידים לסינתזה מוצק בשלב לעומת α-אמינו חומצות נפוצות כוללת את פוטנציאל הזיווגים קשה יותר בשל הין סטריתdrance, הצורך ב-שרף סגר diketopiperazine, ו deprotections בו זמנית (BOC / tBu; Cbz / tBu). המתקשים נוסף טמון בהשגת שחרור הכמותי לעומת שרף באמצעות &quot;הניצרה&quot; השיטה בהשוואה אמצעי יותר קונבנציונאלי. עם גורמים אלה בחשבון, זה אפשרי מאוד אופטימיזציה נוספת של שיטה זו יכולה להיות מושגת ואת המאמצים הנוכחיים נערכים בקבוצה שלנו כדי לשפר את השיטה המוצגת כאן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> HMBA-Am שרף </td><td> NovaBiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> מסרטן </td></tr><tr><td> נטול מים DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> מסרטן </td></tr><tr><td> מימן ברומיד 33% חומצה אצטית </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> רעיל, קורosive, אדים כאשר פתוח </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> DMF </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> AC27960 </td><td> דליק, רעיל </td></tr><tr><td> נטול מים DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> דליק, רעיל </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> טיפים </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> דליק, רעיל </td></tr><tr><td> Piperidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><tdToxic&gt; </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> רעיל </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851055 </td><td> רעיל </td></tr><tr><td> מתיל אדום </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> דליק, חמצן רעיל, יוצרים </td></tr><tr><td> Pyrrolidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> דליק, רעיל, מאכל </td></tr><tr><td> דימתיל Sulfoxide </td><td> דיג </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS כלי התגובה </td><td> חסד </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Series </td><td></td></tr><tr><td> חצי הכנה LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100 Series </td><td></td></tr><tR&gt; <td> Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> ארגון </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

בשנת 1962 פרסם RB Merrifield ההליך הראשון באמצעות מוצק שלב סינתזת פפטיד כדרך חדשנית ביעילות לסנתז פפטידים. טכניקה זו במהירות הוכיח יתרון על פני קודמו פתרון שלב בזמן והן העבודה. שיפורים על מהות תמיכה מוצק, קבוצות להגנה על עובדים ואת שיטות צימוד המועסקים בחמש השנים האחרונות הגדילו רק את השימושיות של המערכת המקורית של Merrifield. כיום, השימוש הגנה BOC מבוסס בסיס / שרף nucleophile אסטרטגיה cleavable או Fmoc מבוסס הגנה שרף חומצי אסטרטגיה cleavable, חלוץ ידי RC שפרד, משמשים בדרך כלל לסינתזה של פפטידים 1. בהשראת אסטרטגיה מוצק של Merrifield תמיכה, פיתחנו BOC / טרט-בוטיל מוצק שלב האסטרטגיה סינתזה להרכבה של פונקציונליות למוצרי פפטידים כתם 2, אשר מתואר להלן. השימוש סינתזה מוצק בשלב לעומת to פתרון שלב המתודולוגיה היא לא רק יתרון בזמן והן העבודה כפי שתואר על ידי Merrifield 1, אלא גם מאפשר בקלות רבה יותר בסינתזה של BIS-peptide ספריות. סינתזה שאנחנו מראים כאן משלב לשלב הסופי מחשוף המשתמשת שני שלבים &quot;בטיחות לתפוס&quot; מנגנון לשחרר פונקציונליות BIS-peptide שרף ידי היווצרות diketopiperazine. כתם למוצרי פפטידים הם נוקשים, ספירו סולם oligomers של ה-BIS-חומצות האמינו כי הם מסוגלים למקם פונקציונליות באופן צפוי designable, שבשליטת בסוג סטריאוכימיה של יחידות monomeric ואת הקישוריות בין מונומר אחד. כל חומצה אמינית-BIS הוא טהור stereochemically, פיגום מחזורית המכילה שתי חומצות אמינו (חומצה carboxylic עם α-אמין) 3,4. המעבדה שלנו חוקרים כעת את הפוטנציאל של פונקציונליות כתם למוצרי פפטידים על פני מגוון רחב של תחומים לרבות, קטליזה אינטראקציות בין חלבונים ו-Nanomaterials.

Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

סינתזה יעילה מוצק בשלב פפטיד של trimer BIS-peptide פונקציונליות ניצול &quot;בטיחות לתפוס&quot; הליך מחשוף שרף HMBA מתואר.

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Research

JoVE Journal

Biology

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...