Name: nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra NIH (R01-HL095828 til MW Kay).

1. Sette opp for studier <ol><li> Forbered fire liter endret Krebs-Henseleit løsning 16 (i mm: 118 NaCl, 3,30 KCl, 2.00 to CaCl, 1.20 4 MgSO, 24,0 3 NaHCO, 1,20 KH 2 4 PO, 10,0 glukose, 2,00 NaPyruvate, og 20,0 mg / L albumin ). Løsningen bør være forberedt så nær starten av eksperimentet som mulig. PH bør justeres til 7,4 etter sterile filtrering (porestørrelse: 22 mikrometer, Corning). Løsning osmolalitet bør være mellom 275 og 295 mOsm / kg. </li><li> Skyll alle rør og kammer av arbeiderklassen hjerte system med renset vann. Kjør pumper før alt vann er fjernet fra systemet. </li><li> Legg cellulose membranfiltre (porestørrelse: 5 mikrometer, Advantec) i tråd med hver av perfusjon pumper (Langendorff perfusjon pumpe, venstre hjerte perfusjon pumpe, og høyre hjerte perfusjon pumpe). </li><li> Utfør en to-punkts kalibrering (0 og 60 mmHg) for hver trykksensor. </li><li>Slå på vannbad. En oppvarmet sirkulerende vannbad (Cole Palmer) brukes til å varme opp vann-Jacketed rør og varmevekslere. Perfusate er forvarmes i et eget vannbad (Oakton Instruments). Begge badene er satt for å opprettholde en løsning temperatur på 37 ° C. </li><li> Slå på pumpene for å sirkulere perfusate i en lukket sløyfe. Perfusate passerer mikrofiber oksygenat (hemofilters) gasset med 95% O 2 og 5% CO 2 ved 80 kPa. Oksygenert perfusate strømmer så gjennom varmevekslere for å opprettholde den ved en temperatur på 37 ° C før de går inn i hjertet kanyler. </li></ol> 2. Hjerte Excision <ol><li> Begynn med å sette arbeiderklassen hjerte-systemet å operere i konstant press Langendorff modus. Still trykket av aorta blokk innenfor området 50-60 mmHg. </li><li> Anesthetize kaninen med en intramuskulær injeksjon av ketamin (44 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Etter at kaninen er bedøvet, pentobarbital (50 mg / Kg) og heparin (2000 U) er intravenøst ​​injiseres via marginal øret blodåre eller lateral saphenous blodåre på innsiden av hind lem. </li><li> Når kaninen er fullstendig ikke-responsive, som bestemmes av en mangel på smerte refleks, er brysthula raskt åpnet, hjerteposen skiver, er aorta festet, og hjertet og lungene blir fjernet. På dette punktet lungene bør overlates festet til hjertet for å hjelpe til med å isolere lungevenene. </li><li> Isolere og cannulate aorta med en 5 mm diameter kanyle som er koblet til en sprøyte fylt med 60 ml perfusate og 200 enheter av heparin. Fest aorta til kanyle med størrelse null silke sutur og langsomt trykke sprøyten for å skylle hjertet av blod. </li></ol> 3. Biventricular kanylering <ol><li> Koble hjerte til aorta blokken av arbeidsdagen hjerte-systemet. Forhindre luft inn i aorta, som kan forårsake koronar emboli. Det er best å feste kanylen til aorta block ved nærmer aorta kontakten i en skrå vinkel og la perfusate å forsiktig dryppe fra kontakten inn kanylen mens den er koblet. </li><li> Mens hjertet er perfused i konstant press Langendorff modus, fjerner fett og bindevev og finn de følgende fartøy: inferior og superior vena cava, azygos vene, lungearterien, lungevenene. </li><li> Ligate superior vena cava. Kutt lungearterien rett under der det greiner til høyre og venstre lunge arteries. </li><li> Gruppe alle de resterende fartøyene (lungevenene) mellom hjertet og lungene, og ligate dem alle ved hjelp av en sutur. Fjern lungene. </li><li> Skjær et lite hull i hjørnet av den venstre atrial vedheng. Sørg for at LA er fylt med perfusate. Cannulate LA samtidig som kanylen er fullstendig fylt med perfusate mens det er satt inn. Suture kanylen til LA vedheng. </li><li> Slå på venstre side pumpen (pumpe nr. 2) for å gi strøm til than forlot atrium. Still preload trykket mellom 2-6 mmHg og justere ± 2 mmHg, som bestemmes av atrial dilatasjon. </li><li> Bytt hjertet til å jobbe hjerte-modus ved å slå av Langendorff pumpen (pumpe # 1). </li><li> Øyeblikk redusere aorta trykket til 10 mmHg og deretter langsomt øke den til innenfor området 80 til 100 mmHg. Dette vil gi aortaklaffen å åpne og fungere som det ville under normale fysiologiske forhold. Den endelige afterload trykket vil avhenge kontraktilitet av LV. Det bør settes til en verdi som er ca 20 mmHg lavere enn peak LV press. </li><li> LV minuttvolum kan bestemmes ved å måle strømningshastighet på perfusate spennende aorta blokk (ml / min). Normal minuttvolum er mellom 14.77 og 16.43 ml / min per 100 g kroppsvekt 17 og gjennomsnitt 340 ml / min for en 2,2 kg kanin. Aorta trykk skal ligne trykket signal vist i figur 1. </li><li> Cannulate RA gjennom inferior vena cava. Sørg for at både RA og kanylen er helt fylt med perfusate og sette kanylen mens hindre dannelse av luftbobler. Suture kanylen til venen. </li><li> Slå på høyre side pumpe (pumpe # 3) å gi flyt til høyre atrium. Still trykket til ca 3 mmHg. </li><li> Sørg for at RV er fylt med perfusate og cannulate lungearterien. Kontroller at kanylen er fullstendig fylt med perfusate mens det er satt inn for å forhindre luftbobler. Suture kanylen til lungearterien. </li></ol> 4. Signal Oppkjøp: press, monofasisk aksjonspotensialer og fNADH <ol><li> Når biventricular kanylering er fullført, forsiktig inn trykkgiveren kateter (Millar) i aorta via aorta kanyle. Forsiktig navigere seg forbi aortaklaffen og inn i LV. Overvåk LV press signal å sikre riktig plassering av kateterspissen. Et eksempel på LV press visesi figur 1. </li><li> Trykk forsiktig monophasic aksjonspotensialet elektrode mot ventrikkel epikard. Overvåk signal for å oppnå hensiktsmessige tiltak potensielle mål. Liten bevegelse gjenstand i signalet er normalt. </li><li> Plasser en bipolar stimulans elektrode på høyre atrium til tempoet hjertet. I protokollen vår, var hjerter tempo på sykluslengder mellom 300 og 150 msek, tilsvarende 200 og 400 bpm, henholdsvis. </li><li> Mål temperaturen på LV epicardial overflaten. Dersom studien krever at temperaturen holdes på 37 ° C og deretter plassere hjertet inne i en vann-Jacketed hjerte kammer eller senk hjertet i en oppvarmet superfusate bad for å opprettholde en konstant temperatur i hele hjertet. </li><li> Plasser CCD kamera (Andor iXon DV860, 128x128 piksler) og fokusere linsen slik at en passende synsfelt er observert. Kameraet er koblet til en arbeidsstasjon og bilder er ervervet ved 2 fps med Andor SOLIS software. </li><li> Slå på kvikksølvlampe lyset før starten av bildebehandling. Lys er rettet gjennom en eksitasjon filter (350 ± 25 nm, Chroma Technology) og inn i en fiberoptisk lys bruksanvisning (Horiba Jobin Yvon modell 1950-1M) for å belyse overflaten av hjertet. Demping av UV-lys igjennom lyset guiden er liten. UV belysning kan også gis ved hjelp av en kraftig LED system bestående av LED spotlights (Mightex PLS-0365-030-S) og en styringsenhet (Mightex SLC-SA04-USA). </li><li> Slå av lyset i rommet og minimere eventuelle rombelysning. Rett endehylser av lyset guide (eller LED spotlights) i hjertet for å oppnå jevn epicardial belysning. Avgitt NADH fluorescens (fNADH) passerer gjennom en emisjon filter (460 ± 20 nm Chroma Technology) og avbildes av CCD-kamera. </li><li> Overvåk fNADH endringer over tid ved å velge et område av interesse å bruke bildebehandlingsprogrammer. Velg leve-oppdatere modus for å overvåke den gjennomsnittlige pikselintensiteten innen regionen of interesse. </li><li> Hjertet skal fungere i biventricular arbeider modus for å generere hensiktsmessige press. fNADH nivåer bør være lav og stabil over epicardial overflaten for å bekrefte adekvat koronar perfusjon. På dette punktet i undersøkelsen en bestemt eksperimentell protokoll bør gjennomføres for å teste en hypotese. </li><li> Når studiet er fullført, fjerner hjerte fra systemet og tømme alle perfusate. Skyll systemet slangen og kamre med renset vann. For rutinemessig vedlikehold, bør systemet med jevne skylles med Mucasol løsning eller en fortynnet hydrogenperoksid løsning, etter behov. </li></ol> 5. Off-line Behandling av fNADH Images <ol><li> En måte å sammenligne NADH datasett (fNADH (i, j, t)) mellom eksperimenter er å normalisere hvert fluorescens bilde med en referanse bilde (fNADH (i, j, t 0)) fra datasettet 9, som vist i ligningen nedenfor . En annen måte å normalisere NADH fluorescens er å pless et lite stykke uranyl glass i synsfeltet før eksperimentet 9, 18, ​​19. Uranyl glass vil fluorescens (450-550 nm) når belyst med UV lys for å gi et signal som kan brukes som en stabil referanse. </li></ol><img alt="Formel 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Representative Resultater Fremre og basal utsikt over en biventricular jobbe kanin hjerte forberedelse er vist i figur 1. Venstre ventrikkel trykket ble målt ved å navigere en trykkgiver kateter (Millar SPR-407) forbi aortaklaffen og inn i venstre hjertekammer. Aorta, lungearterien, og venstre ventrikkel press (LVP) er vist i figur 1C. Diastolisk LVP er vanligvis mellom 0 og 10 mmHg. Minste diastolisk aorta trykket er ca 60 mmHg. Peak systolisk LVP er avhengig fyllingstrykk (den preload eller LA pressure) og kontraktilitetog optimalt, bør være mellom 80 og 100 mmHg. Den maksimale aorta trykk og maksimal LVP bør samsvare, som vist i figur 1C. Monofasisk aksjonspotensialer (kart) med en rask depolarisering fase og en repolarisering fase som er typisk for kanin hjerter er vist i figur 1D. Kart kan registreres relativt enkelt fra en kontraherende hjerte, men vil vanligvis ha liten bevegelse gjenstand under diastole, som vist i Figur 1D. Kart er nyttig for å bekrefte vellykket entrainment av hjertet (capture) under pacing og kan også brukes til å måle lokale elektrofysiologiske endringer på grunn av iskemi eller andre akutte forstyrrelser. En EKG kan også måles ved å nedsenke hjertet i et badekar med varmt superfusate og plassere en elektrode i badekaret på venstre og høyre side av hjertet. En tredje likegyldig elektrode er enten plassert i badekaret, fra hjertet, eller er festet til aorta.En EKG vil gi informasjon om den globale eksitasjon og repolarisering prosess, noe som er nyttig for å vurdere samlet elektrisk funksjon og for å avsløre tilstedeværelsen av iskemi. fNADH bildebehandling avslører endringer i mitokondrie redoks tilstand av hjertet, som kan brukes til å måle spatiotemporal progresjon av iskemiske eller hypoksisk regioner. For denne studien, ble epicardial fNADH målt til å overvåke endringer i redoks staten i løpet av tre pacefrekvenser på sykluslengder (CLS) på 300, 200 og 150 msek. Gjennomsnittlig fNADH verdier fra en region av interesse (rød boks, figur 2) viser at utgangsverdiene fNADH nivåene øke etter hvert som sykluslengde er forkortet. Når pacefrekvensen er nær sinusrytme (CL = 300 ms) baseline fNADH nivå er relativt konstant. Som sykluslengde forkortes under 300 msek, baseline fNADH nivåene øker, med den største økningen på kortest CL (150 msek). Høy oppløsning fNADH avbildning av hele fremre flatenved 200 og 400 bpm er vist i figur 3. fNADH nivåer ved 200 bpm var konstant og romlig homogene. Ved 400 bpm, økte fNADH nivåer vesentlig utover epikard. Signifikant romlig heterogenitet ble observert med den største økningen skjer innenfor septal regioner i RV og LV. Den fNADH signal svinger med kontraksjon (bevegelse gjenstand) og hyppigheten av pendling tilsvarer hjertefrekvens (figur 2). I biventricular kanylering, er bunnen av hjertet holdt av fire kanyler, som bidrar til å forhindre hjerte fra svingende under sammentrekning. Derfor er svingningen amplitude alltid mindre enn lenger tid skala (5-10 sek) trender i fNADH som er forårsaket av iskemi eller hypoksi. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figur 1. Typiske trykk og monofasisk aksjonspotensialer fra en isolert biventricular arbeider rabbit hjerte. A. Basal visning av hjertet viser fire kanyler: 1, aorta, 2, lungearterien, 3, venstre atrie, og 4, høyre atrial B. Anterior syn på hjertet viser venstre ventrikkel (LV) og høyre ventrikkel. (RV). C. Representative press. Top: venstre ventrikkel trykk (heltrukket linje) og aorta trykket (stiplet linje). Bunn:. Pulmonalt trykk D. Representative monofasisk aksjonspotensialer. Signalet er på linje med det presset som er vist i panelet C. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figur 2. fNADH avbildning av en isolert biventricular jobber kanin hjerte. Top: En tegneserie av synsfeltet (til venstre) og tre fNADH bildene vises. Den tilsvarende pacing sykluslengde (CL) er angitt på hvert bilde.Regionen av interesse for fNADH signal i det nedre panelet indikeres av den røde boksen. Tuppen av monophasic aksjonspotensialet elektroden sees til høyre for regionen av interesse. Epikard ble opplyst ved hjelp av kvikksølv lampe og lys guide, som vist i figur 5. Bare epicardial overflaten omkringliggende regionen av interesse ble opplyst Bunn:. Gjennomsnittlig fNADH for regionen av interesse angitt med røde boksen øverst til panelet. Gjennomsnittlig fNADH øker med redusert syklus lengde. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figur 3. fNADH bilder av hele fremre overflate av en isolert biventricular jobber kanin hjertet. Hjertet var tempo fra RA på 200 bpm og 400 bpm. fNADH ble fotografert (2 fps, 128x128 piksler med en oppløsning på 0,4 mm), mens belysning av hele fremre epikard bruke to kraftige LED (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

<ol>
	<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+am+uberlebenden+saugethierherzen+[investigations+on+the+surviving+mammalian+heart].">Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart].</a> Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 .</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).</li><li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart.">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).</li><li>Feng, H. Z., Jin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+cardiac+troponin+T+variants+reduces+heart+efficiency.">Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).</li><li>Clemens, M. G., Forrester, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+adenosine+triphosphate+in+the+coronary+sinus+effluent+from+isolated+working+rat+heart+in+response+to+hypoxia.">Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia.</a> J. Physiol. 312, 143-158 (1981).</li><li>Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+fat+diet+increases+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+and+uncoupling+to+decrease+efficiency+in+rat+heart.+Basic+Res.">A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res.</a> Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).</li><li>Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load-insensitive+measurements+from+an+isolated+perfused+biventricular+working+rat+heart.">Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart.</a> J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).</li><li>Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+biventricular+working+rat+heart+preparation.">Isolated biventricular working rat heart preparation.</a> Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).</li><li>Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locations+of+ectopic+beats+coincide+with+spatial+gradients+of+NADH+in+a+regional+model+of+low-flow+reperfusion.">Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).</li><li>Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+regional+hypoperfusion+in+langendorff+heart+preparations.">Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations.</a> Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).</li><li>Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+contrast+ultrasound+and+NADH+fluorescence+imaging+of+myocardial+perfusion+in+excised+rat+hearts.">High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts.</a> , 1-4 (2008).</li><li>Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyridine+nucleotide+as+an+indicator+of+the+oxygen+requirements+for+energy-linked+functions+of+mitochondria.">Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria.</a> Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).</li><li>Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+vivo+evaluated+by+NADH+fluorescence:+From+animal+models+to+human+studies.">Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).</li><li>Barlow, C. H., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+areas+in+perfused+rat+hearts:+Measurement+by+NADH+fluorescence+photography.">Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography.</a> Science. 193, 909-910 (1976).</li><li>Mayevsky, A., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+states+of+NADH+in+vivo:+From+animals+to+clinical+use.">Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use.</a> Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).</li><li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused,+isolated,+working+rabbit+heart.">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).</li><li>Ôta, K., Peaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactation+in+the+rabbit:+Mammary+blood+flow+and+cardiac+output.">Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output.</a> Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).</li><li>Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+ischemia+in+hypertrophic+langendorff-perfused+rat+hearts.">Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts.</a> Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).</li><li>Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+cardiac+work+is+associated+with+decrease+of+mitochondrial+NADH.">Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH.</a> Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).</li><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ. Res. 95, 21-33 (2004).</li><li>Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoramic+optical+mapping+reveals+continuous+epicardial+reentry+during+ventricular+fibrillation+in+the+isolated+swine+heart.">Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart.</a> Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).</li><li>Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+panoramic+imaging+of+cardiac+arrhythmias+in+rabbit+heart.">Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart.</a> J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).</li><li>Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+four-chamber+working+swine+heart+model.">Isolated four-chamber working swine heart model.</a> Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).</li><li>Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+human+hearts.">In vitro studies of human hearts.</a> Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).</li><li>Schenkman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+performance+as+a+function+of+intracellular+oxygen+tension+in+buffer-perfused+hearts.">Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).</li><li>Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+by+nifedipine+in+isolated+working+hearts:+A+comparative+study+on+three+different+types+of+experimental+ischemia.">Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).</li><li>Khatib, S. Y., Boyett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glyburide+(glibenclamide)+on+myocardial+function+in+langendorff+perfused+rabbit+heart+and+on+myocardial+contractility+and+slow+calcium+current+in+guinea-pig+single+myocytes.">Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes.</a> Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).</li><li>Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+albumin+on+the+electrophysiologic+stability+of+isolated+perfused+rabbit+hearts.">Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).</li><li>Combs, C. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+(ED-FRAP).">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li><li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Semi-)quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart.">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li><li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH,+cytosolic+redox+state,+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts.">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li><li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism.">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Den isolerte Langendorff perfused hjerte forblir en fremtredende verktøy for å studere hjertets fysiologi to. Det er spesielt nyttig i studier av hjertearytmier, spesielt de som bruker fluorescens avbildning av transmembrane potensial 20. En fordel er at hele epikard av den isolerte hjertet kan observeres 21, 22. En annen fordel er at, i motsetning til blod, ikke perfusjon med en klar crystalloid bufferløsning ikke forstyrre fluorescens signaler. En begrensning er at Langendorff teknikken ikke er godt egnet for studier av hjerte-metabolisme, som ofte krever at hjertet til å utføre arbeid innenfor rammen av fysiologisk forspenning og afterload press. For å heve relevansen av isolerte hjertefeil preparater for metabolske studier, Neely innført endringer i Langendorff teknikken å etablere hensiktsmessige venstre ventrikkel (LV) forspenning og afterload press 3.Modellen er kjent som den isolerte LV arbeids hjerte modell, og har blitt brukt mye til å studere LV ytelse og metabolisme 4-6. LV arbeider hjerte modellen er overlegen til Langendorff modell for funksjonelle evalueringer, men det gir ikke et riktig lastet høyre ventrikkel (RV). Demmy et al. først rapportert en biventricular modell (LV &amp; RV) som en modifikasjon av LV arbeidende hjerte modell 7, 8. De fant at slagvolum, minuttvolum, og press utvikling forbedret i hjerter konverteres fra arbeidslivet LV-modus til biventricular jobbe modus åtte. Et riktig lastet RV forbedrer også septal funksjon ved å svekke unormale trykkgradienter over septum. Biventricular arbeider hjerter har vist seg å vedlikeholde aorta utgang, lunge flyt, mener aorta press, mener pulmonalt trykk, hjertefrekvens og hjerteinfarkt ATP, og kreatinfosfat nivåer i opptil 3 timer 8. Biventricular arbeider hjerte studier bruker vanligvis hjerter frOM små dyr, som for eksempel rotter og kaniner, fordi minuttvolum og den nødvendige volumet av perfusate er mye mindre enn for hjerter av større dyr. Imidlertid har biventricular arbeider hjerte studier blitt utført med hjerter fra svin, hjørnetenner, og selv mennesker 23, 24. Den metabolske etterspørsel av isolerte hjerter i biventricular driftsfunksjonen er betydelig høyere enn for Langendorff perfusjon. Det er viktig at perfusate løsningen gi nok oksygen og metabolske substrat til støtte biventricular hjertefunksjon. Standard crystalloid buffer løsninger, for eksempel 16 Krebs-Henseleit, 17, 25 eller 26 Tyrodes, 27, har oksygen løselighet så høyt som 5,6 mg / L. Når disse løsningene er gasset med carbogen (en gass blanding av 95% O 2 og 5% CO 2) og inneholde passende metabolsk substrat (glukose, druesukker, og / eller natrium pyruvat), er de egnet for biventricular arbeider hjerter bankende på normal Sinus priser (ca 180 bpm for en kanin). Metabolske etterspørselen øker for raske rytmer og mengden av oksygen oppløst i standard perfusates kanskje ikke være nok til å gi full støtte en biventricular arbeider hjerte som er oppdragsgiver ved høye priser. Crystalloid bufferløsningene inneholder erytrocytter eller blandet med fullblod har vært brukt i arbeidstiden hjerte forberedelser for å sikre tilstrekkelig oksygen tilgjengelighet. Tidligere studier har vist at å legge erytrocytter til en Krebs-Henseleit løsning bedre arbeidsmiljø hjertefunksjonen under strenge pacing protokoller og også redusert forekomst av ventrikkelflimmer 16. En begrensning av bruk av erytrocytter eller blandinger av fullblod er at hemoglobin forstyrrer lysbølgelengder som brukes for fluorescens bildebehandling 13. Andre underlag, for eksempel albumin, kan også legges til perfusate løsninger for å forlenge hjerte levedyktighet og redusere ødem 28. Under fluorescens avbildning intensiteten av eksitasjon lys bør være høy og lys fordelingen bør være ensartet. Oppnå jevn belysning er ikke alltid lett på grunn av krumning av epicardial overflaten. I våre studier har vi bilde fNADH ved å filtrere lys (350 ± 25 nm) fra en kvikksølv lampe. En splittnagler fiberoptisk lys guide brukes til å dirigere UV-lys på epicardial overflaten. Uniform belysning kan oppnås ved riktig posisjonering de to output endehylser. UV LED lyskilder kan også brukes, som vi har vist i Figur 3. LED kilder er relativt billig så flere kilder kunne innlemmes i en avbildning system. LED kan også syklet på og av ved høye priser for å synkronisere eksitasjon lys med bilde oppkjøpet. Photobleaching av NADH bør minimaliseres 29 ved å redusere tiden av vev belysning. Dette kan gjøres ved å sykle belysningen på og av med et elektronic lukkeren og en lampe eller med en LED belysning system og en kontroller. Dersom belysning er synkronisert med hjertets syklus, så fNADH bilde oppkjøpet kan bli bundet til diastole, noe som ville redusere bevegelse gjenstand i fluorescens signaler. Trigging belysning og bilde innsamlingen med et trykk signal, som LV press, ville være en måte å gjøre dette. I våre studier har vi sett at endringer i fNADH per tidsenhet kan være mer enn 5x høyere ved 400 bpm enn på 200 bpm. Dette indikerer at raske rytmer heve redoks staten hjertet. Hvorvidt dette er forårsaket av hypoksi eller manglende evne myocytes å oksidere NADH til NAD + raskt nok til å unngå opphopning av NADH er fortsatt et ubesvart spørsmål. Ytelsen til en biventricular jobbe hjerte forberedelse er betinget av flere faktorer. En av de viktigste er å stille egnede forspenning og afterload press for å etterligne den fysiologiskeforhold som er under etterforskning. Spesielt må LV afterload (aorta trykk) justeres for å representere systemisk press. Hvis den er for høy, vil LV ikke kunne overvinne trykket, noe som resulterer i oppgulp. Trykk som er for lavt, vil påvirke koronar perfusjon. LV preload trykket (til venstre atrie trykk) bør også tilpasses for å gi en slutt diastolisk volum som passer for den forsøksprotokoll. fNADH avbildning av levende vev er en etablert måte å fluorescens bildebehandling 13. Sin søknad til hjertevev ble illustrert av Barlow og Chance da de rapporterte slående forhøyelser av fNADH innenfor regionalt iskemisk vev etter ligation av en koronar fartøy 14. Deres fNADH bildene ble tatt på film med en Fairchild oscilloskop kamera og UV blitsfotografering. Coremans et al. utdypes dette konseptet bruker NADH fluorescens / UV refleksjon forhold til å målee det metabolske tilstand epikard av Langendorff blod-perfused rotte hjerter 30. En videofluorimeter ble brukt for bildebehandling og data ble registrert ved hjelp av en video-opptaker. Senere Scholz et al. brukt en spektrograf og fotodiode utvalg for å måle gjennomsnittlig fNADH fra et stort område av LV. Denne tilnærmingen reduserte effekten av epikardiale fluorescens heterogeniteter og lokale variasjoner i omløp mens avslørende makroskopiske arbeidsrelaterte varianter av fNADH 31. Denne tilnærmingen er lik databehandling gjennomsnittlig fNADH nivåer for en region av interesse på tvers av alle rammer i en fNADH bildebehandling datasettet, som illustrert i figur 2. Som vi har presentert i denne artikkelen, gir dagens teknologi høyhastighetstog CCD-kameraer og digitalt kontrollert kraftige UV spotlights. Disse teknologiene gjør de spatiotemporal dynamikken i fNADH og hjerte metabolisme å bli studert fra mange nye perspektiver. Den relativt lave kostnaden av optikk og lyskilde gjør fNADH bildebehandling en nyttig tilbehør for konvensjonelle kardiale optiske kartsystemer. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Kjemisk </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glukose </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158 968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumin </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts

Siden starten av Langendorff 1, forblir isolert perfused hjertet en fremtredende verktøy for å studere hjertets fysiologi to. Det er imidlertid ikke godt egnet for studier av hjerte-metabolisme, som krever at hjertet til å utføre arbeid innenfor rammen av fysiologisk forspenning og afterload press. Neely innført endringer av Langendorff teknikk for å etablere hensiktsmessige venstre ventrikkel (LV) forspenning og afterload press 3. Modellen er kjent som den isolerte LV arbeids hjerte modell, og har blitt brukt mye til å studere LV ytelse og metabolisme 4-6. Denne modellen, derimot, gir ikke et riktig lastet høyre ventrikkel (RV). Demmy et al. først rapportert en biventricular modell som en modifikasjon av LV arbeidende hjerte modell 7, 8. De fant at slagvolum, minuttvolum, og press utvikling forbedret i hjerter konverteres fra arbeidslivet LV-modus til biventricular arbeidsmodus 8 </sup&gt;. Et riktig lastet RV minsker også unormale trykkgradienter over septum å forbedre septal funksjon. Biventricular arbeider hjerter har vist seg å vedlikeholde aorta utgang, lunge flyt, mener aorta trykk, puls, og hjerteinfarkt ATP nivåer i opptil 3 timer 8. Når studere metabolske effekter av skade på hjertet, for eksempel iskemi, er det ofte nødvendig å identifisere plasseringen av det berørte vevet. Dette kan gjøres ved avbildning fluorescens av NADH (redusert form av nikotinamid adenindinukleotid) 9-11, et koenzym som finnes i store mengder i mitokondriene. NADH fluorescens (fNADH) viser en nær lineært inverse forholdet med lokal oksygenkonsentrasjon 12 og gir et mål på mitokondriell redoks staten 13. fNADH bildebehandling under hypoksisk og iskemisk forholdene har blitt brukt som en dye-fri metode for å identifisere hypoksisk regioner 14, 15 og å overvåke utviklingen avhypoksisk forhold over tid 10. Målet med metoden er å overvåke den mitokondrielle redoks staten biventricular arbeider hjerter i løpet av protokoller som endrer frekvensen av myocyte metabolisme eller indusere hypoksi eller lage en kombinasjon av de to. Hearts fra New Zealand hvite kaniner var koblet til en biventricular jobbe hjerte system (Hugo Sachs Elektronik) og perfused med modifisert Krebs-Henseleit løsning 16 ved 37 ° C. Aorta, LV, lungearterien, og venstre &amp; høyre atrial press ble registrert. Elektrisk aktivitet ble målt ved hjelp av en monofasisk aksjonspotensial elektroden. Slik image fNADH, ble lyset fra en kvikksølvlampe filtrert (350 ± 25 nm) og brukes til å belyse epikard. Lyset ble filtrert (460 ± 20 nm) og avbildes med en CCD-kamera. Endringer i epicardial fNADH av biventricular arbeider hjerter under forskjellige pacefrekvenser presenteres. Kombinasjonen av hjertet modellen og fNADH bildebehandlinggir en ny og verdifull eksperimentell verktøy for å studere akutte kardiale patologi innenfor rammen av realistiske fysiologiske forhold.

Watch this Scientific Journal Video about NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts at JoVE.com

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Målet er å overvåke den mitokondrielle redoks staten isolerte hjerter innenfor rammen av fysiologisk forspenning og afterload press. En biventricular arbeider kanin hjerte modell presenteres. Høy spatiotemporal oppløsning fluorescens avbildning av NADH brukes til å overvåke mitokondrielle redoks staten epicardial vev.

NADH Fluorescens Imaging av isolerte Biventricular Arbeide Rabbit Hearts

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo avbildning av tumor angiogenese med fluoresens Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyocardial Cell Levering: Observasjoner i murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Et isolert Working Hjerte System for stort dyr modeller

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Arbeide med menneskelig vev for translasjonell kreftforskning

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-mediert tomografi av kvantifisering av Macrophage-relaterte Murine intestinale betennelsen

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Semi-Minimal Invasiv metode for å indusere hjerteinfarkt hos rotter og vurdering av hjertefunksjon av et isolert arbeidshjertesystem

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Biventricular Assessment of Cardiac Function and Pressure-Volume Loops by Closed-Chest Catheterization in Mice

Biventrikulær vurdering av hjertefunksjon og trykk-volum-sløyfer ved lukket brystkateterisering hos mus

Assessment of cardiac function is essential to conduct cardiovascular and pulmonary-vascular preclinical research. Pressure-volume loops (PV loops) ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Raffinert CLARITY-basert vevsrydding for tredimensjonal fibroblastorganisasjon i sunne og skadde musehjerter

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

Isolert lungeperfusjonssystem i kaninmodellen

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...