Name: nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00
Duration: 12 min 7 s
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Este trabalho foi financiado por uma subvenção do NIH (R01-HL095828 para Kay MW).

1. Configurando para o Estudo <ol><li> Preparar quatro litros de solução modificada de Krebs-Henseleit 16 (em mM: NaCl 118, KCl 3,30, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSO4, 24,0 NaHCO3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glicose, 2,00 NaPyruvate, e 20,0 mg / L de albumina ). A solução deve ser preparada como se perto do início da experiência quanto possível. O pH deve ser ajustado para 7,4 após a filtragem estéreis (tamanho de poro: 22 uM, Corning). Osmolalidade da solução deve situar-se entre 275 e 295 mOsm / kg. </li><li> Lavar todos os tubos e as câmaras de trabalho do coração do sistema com água purificada. Executar bombas até que toda a água ter sido removido do sistema. </li><li> Adicionar filtros de membrana de celulose (dimensão do poro: 5 m, Advantec), em conformidade com cada uma das bombas de perfusão (Langendorff bomba de perfusão, a bomba de perfusão do coração esquerdo, e uma bomba de perfusão do coração direito). </li><li> Realizar uma calibração de dois pontos (0 e 60 mmHg) para cada sensor de pressão. </li><li>Ligue os banhos de água. Um banho de água aquecida circulantes (Cole Palmer) é utilizado para aquecer os tubos jaqueta de água e permutadores de calor. Perfusato é pré-aquecida num banho de água separada (Oakton Instruments). Ambos os banhos são ajustados para manter uma temperatura de solução de 37 ° C. </li><li> Ligar as bombas para circular o perfusato num circuito fechado. Perfusato passa através oxigenadores microfibra (hemofiltros) gaseificada com 95% de O2 e 5% de CO2 a 80 kPa. Perfusato oxigenado então flui através permutadores de calor para mantê-lo a uma temperatura de 37 ° C antes de entrar no cânulas coração. </li></ol> 2. Excisão Coração <ol><li> Comece por definir o sistema de coração a trabalhar para operar em modo de pressão constante Langendorff. Regule a pressão do bloco da aorta dentro do intervalo de 50 a 60 mmHg. </li><li> Anestesiar o coelho com uma injecção intramuscular de cetamina (44 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Após o coelho é sedado, pentobarbital (50 mg / Kg) e heparina (2000 U) é injectados intravenosamente através da veia marginal da orelha ou a veia safena lateral, do lado de dentro do membro posterior. </li><li> Quando o coelho é completamente não-responsivo, tal como determinado por uma falta de dor reflexa, a cavidade torácica é rapidamente aberto, o pericárdio é cortada, a aorta é fixada, eo coração e os pulmões são excisados. Neste ponto, os pulmões devem ser unida ao coração para ajudar com isolando as veias pulmonares. </li><li> Isolar e canular a aorta com uma cânula de diâmetro 5 mm que está ligada a uma seringa preenchida com 60 ml de perfusato e 200 unidades de heparina. Proteger da aorta para a cânula com tamanho de sutura de seda zero e lentamente deprimir a seringa para lavar o coração de sangue. </li></ol> 3. A canulação biventricular <ol><li> Ligue o coração para o bloco da aorta do sistema de coração de trabalho. Prevenir a entrada de ar da aorta, que pode causar embolia coronária. É melhor para prender a cânula da aorta para o block aproximando o conector da aorta num ângulo oblíquo e permitindo perfusato suavemente para escorrer desde o conector para dentro da cânula enquanto ele está ligado. </li><li> Enquanto o coração é perfundido no modo de pressão constante Langendorff, retire a gordura e tecido conjuntivo e localizar os seguintes navios: inferior e veia cava superior, veia ázigos, artéria pulmonar, veias pulmonares. </li><li> Ligadura da veia cava superior. Corte a artéria pulmonar logo abaixo de onde se ramifica para as artérias pulmonares direita e esquerda. </li><li> Grupo de todos os vasos restantes (das veias pulmonares) entre o coração e os pulmões e ligar todos eles usando uma sutura. Remover os pulmões. </li><li> Corte um pequeno buraco no canto do apêndice atrial esquerdo. Certifique-se que a LA está cheio de perfusato. Canular a LA assegurando ao mesmo tempo que a cânula é completamente preenchida com perfusato enquanto ele é inserido. Suturar a cânula ao apêndice LA. </li><li> Ligue o lado esquerdo da bomba (bomba # 2) para fornecer um caudal de tele átrio esquerdo. Regule a pressão pré-carga entre 2-6 mmHg e ajustar ± 2 mmHg, tal como determinado pela dilatação atrial. </li><li> Mudar o coração para o modo de trabalho do coração, desligando a bomba Langendorff (bomba # 1). </li><li> Momentaneamente diminuir a pressão aórtica a 10 mmHg e, em seguida, lentamente aumentá-la para dentro do intervalo de 80 a 100 mmHg. Isto irá permitir que a válvula aórtica para abrir e funcionar como seria durante condições fisiológicas normais. A pressão de pós-carga final irá depender da contractilidade do VE. Ele deve ser definido para um valor que é cerca de 20 mmHg inferior a pico de pressão do VE. </li><li> LV débito cardíaco pode ser determinada pela medição da taxa de fluxo de perfusato sair do bloco da aorta (mL / min). Débito cardíaco normal está entre 14,77 e 16,43 mL / min por 100 g de peso corporal 17 e médias 340 mL / min para um coelho kg 2,2. Pressão aórtica deve ser semelhante ao sinal de pressão mostrado na Figura 1. </li><li> Canular a RA através do inferior veia cava. Assegure-se que tanto a AR ea cânula são completamente preenchido com perfusato e inserir a cânula enquanto impede a formação de bolhas de ar. Suturar a cânula na veia. </li><li> Ligue o lado direito da bomba (bomba # 3) para fornecer o fluxo para a aurícula direita. Regule a pressão para aproximadamente 3 mmHg. </li><li> Assegurar que o RV é preenchido com perfusato e canular a artéria pulmonar. Assegure-se que a cânula é completamente preenchida com perfusato enquanto ele é inserido para evitar bolhas de ar. Suturar a cânula na artéria pulmonar. </li></ol> 4. Aquisição do Sinal: Pressões, potenciais de ação monofásico, e fNADH <ol><li> Uma vez que a canulação biventricular está completa, cuidadosamente inserir o cateter transdutor de pressão (Millar) na aorta através da cânula da aorta. Gentilmente navegá-lo para além da válvula aórtica e para o LV. Monitorizar o sinal de pressão do VE para garantir o posicionamento correcto da ponta do cateter. Um exemplo da pressão do VE é mostradona Figura 1. </li><li> Pressione suavemente o eléctrodo de potencial monofásico ação contra epicárdio ventricular. Monitorar o sinal para alcançar medidas de potencial de ação apropriadas. Artefacto ligeiro movimento no sinal é normal. </li><li> Coloque um eléctrodo bipolar estímulo no átrio direito a andar o coração. No nosso protocolo, os corações foram ritmo, em comprimentos de ciclo entre 300 e 150 mseg, correspondendo a 200 e 400 bpm, respectivamente. </li><li> Medir a temperatura da superfície do epicárdio do VE. Se o estudo exige que a temperatura seja mantida a 37 ° C, em seguida, posicionar o coração dentro de uma câmara do coração de água com camisa ou submergir o coração num banho de superfusate aquecido para manter uma temperatura constante durante todo o coração. </li><li> Posicione a câmera CCD (Andor ixon DV860, 128x128 pixels) e focar a lente de tal forma que um campo apropriado do ponto de vista é observado. A câmera é conectada a uma estação de trabalho e as imagens são adquiridas em 2 fps usando Andor SOLIS software. </li><li> Ligar a luz da lâmpada de mercúrio antes do início das imagens. A luz é dirigida através de um filtro de excitação (350 ± 25 nm, Tecnologia Chroma) e em um guia de luz de fibra óptica (Horiba Jobin Yvon modelo 1950-1M) para iluminar a superfície do coração. A atenuação da luz UV por meio do guia de luz é pequena. Iluminação UV pode ser feita utilizando um sistema de LED de alta potência composto por luzes LED (Mightex PLS-0365-030-S) e uma unidade de controle (Mightex SLC-SA04-US). </li><li> Desligue a luz ambiente e minimizar qualquer tipo de iluminação ambiente. Mire as virolas do guia de luz (ou projectores LED) no coração para atingir a iluminação epicárdica uniforme. Emitida NADH fluorescência (fNADH) passa através de um filtro de emissão (460 ± 20 nm Tecnologia Chroma) e é representada pela câmara CCD. </li><li> Monitorar as mudanças fNADH ao longo do tempo, selecionando uma região de interesse utilizando o software de imagem. Selecione viver-atualizar o modo de monitorar a intensidade de pixel média na região of interesse. </li><li> O coração deve estar funcionando no modo de trabalhar biventricular para gerar pressões adequadas. níveis fNADH deve ser baixa e estável ao longo da superfície epicárdica para confirmar a perfusão coronária adequada. Neste ponto no estudo um protocolo experimental específico devem ser implementados para testar uma hipótese. </li><li> Quando o estudo estiver concluído, remova o coração do sistema e drenar toda a perfusato. Enxaguar o tubo do sistema e câmaras com água purificada. Para a manutenção de rotina, o sistema deve ser periodicamente lavados com solução Mucasol ou uma solução de peróxido de hidrogénio diluído, conforme necessário. </li></ol> 5. Off-line Processamento de Imagens fNADH <ol><li> Uma forma de conjuntos de dados de comparação NADH (fNADH (i, j, t)) entre os experimentos é normalizar cada imagem de fluorescência usando uma imagem de referência (fNADH (i, j, t 0)) a partir do conjunto de dados de 9, como mostrado na equação abaixo . Outra forma de normalizar NADH fluorescência é plÁs um pequeno pedaço de vidro de uranilo no campo de visão antes da experiência 9, 18, ​​19. Vidro de uranilo vontade de fluorescência (450 - 550 nm) quando iluminada com luz UV para proporcionar um sinal que pode ser utilizado como uma referência estável. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Os resultados representativos Vistas anterior e basal de uma preparação de coração de coelho trabalhando biventricular são mostrados na Figura 1. Pressão do ventrículo esquerdo foi medido por navegar um cateter transdutor de pressão (Millar SPR-407) para além da válvula aórtica e para o ventrículo esquerdo. Pressões artéria aorta, pulmonar, e do ventrículo esquerdo (LVP) são mostrados na Figura 1C. LVP diastólica é geralmente entre 0 e 10 mmHg. A pressão aórtica diastólica mínimo é de cerca de 60 mmHg. Pico sistólico LVP é dependente de pressão de enchimento (a pré-carga ou pressão LA) e contratilidadee, optimamente, deve estar entre 80 e 100 mmHg. A pressão máxima da aorta e máximo LVP deve corresponder estreitamente, como mostrado na Figura 1C. Potenciais de acção monofásica (MAPs) com uma fase de despolarização rápido e uma fase de repolarização que são típicos para corações de coelho são mostrados na Figura 1D. MAPs pode ser gravado de forma relativamente fácil de um coração contratante, mas terá geralmente artefacto pequeno movimento durante a diástole, como mostrado na Figura 1D. MAPs são úteis para a confirmação de arrastamento bem sucedida do coração (captura) durante a estimulação e também pode ser usado para medir as alterações locais electrofisiológicos devido à isquemia ou outras perturbações agudas. Um ECG poderia também ser medido por submersão do coração em um banho de superfusate quente e colocando um eléctrodo no banho nos lados esquerdo e direito do coração. Um terceiro eléctrodo indiferente ou é colocado no banho, para fora do coração, ou está ligado à aorta.Um ECG irá fornecer informações sobre a excitação global e processo de repolarização, que é útil para avaliar a função eléctrica global e para revelar a presença de isquemia. fNADH imagiologia revela alterações no estado redox mitocondrial do coração, que podem ser utilizados para medir a progressão espaço-temporal das regiões isquémicas ou hipóxico. Para este estudo, epicárdica fNADH foi medida para monitorar mudanças no estado redox durante três taxas de estimulação na duração do ciclo (CLS) de 300, 200 e 150 ms. Os valores médios fNADH a partir de uma região de interesse (caixa vermelha, Figura 2) mostram que os níveis basais fNADH aumentar à medida que o comprimento do ciclo é encurtado. Quando frequência de estimulação está perto de ritmo sinusal (CL = 300 ms) basal nível fNADH é relativamente constante. Como a duração do ciclo é reduzido abaixo de 300 ms, base fNADH aumento dos níveis, com o maior aumento no menor CL (150 ms). Alta resolução fNADH imagem da superfície total anteriora 200 e 400 bpm é mostrado na Figura 3. níveis fNADH a 200 bpm eram constantes e espacialmente homogênea. A 400 batimentos por minuto, os níveis de fNADH aumentou substancialmente ao longo do epicárdio. Heterogeneidade espacial significativa foi observada com os maiores aumentos ocorreram nas regiões do septo do VD e VE. O sinal de fNADH oscila com contracção (artefacto de movimento) ea frequência de oscilação corresponde à frequência cardíaca (Figura 2). Em canulação biventricular, a base do coração é mantido por 4 cânulas, o que ajuda a impedir que o coração de balançar durante a contracção. Portanto, a amplitude de oscilação é sempre menor do que qualquer escala mais tempo (seg 5-10) tendências fNADH que são causadas por isquemia ou hipóxia. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figura 1. Pressões típicas e os potenciais de ação monofásico de um biventricular isolado rabbit coração. A. vista Basal do coração, mostrando as cânulas quatro: 1, da aorta; 2, artéria pulmonar; 3, da esquerda atrial; e 4, atrial direita B. vista anterior do coração mostrando o ventrículo esquerdo (LV) e do ventrículo direito. (RV). C. pressões representativas. Top: pressão ventricular esquerda (linha sólida) ea pressão aórtica (linha pontilhada). Conclusão: pressão pulmonar. D. Representante monofásicos potenciais de ação. O sinal é alinhado com as pressões mostrado no painel C. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figura 2. fNADH imagem de um biventricular isolado coração de coelho. Top: Um desenho do campo de visão (esquerda) e três imagens fNADH são mostrados. O comprimento do ciclo de estimulação correspondente (CL) é indicado em cada imagem.A região de interesse para o sinal de fNADH no painel de fundo é indicado pela caixa vermelha. A ponta do eléctrodo do potencial de acção monofásica é visto à direita da região de interesse. O epicárdio foi iluminada usando uma lâmpada de mercúrio e de guia de luz, como mostrado na Figura 5. Apenas a superfície epicárdica em torno da região de interesse foi iluminada inferior:. FNADH média para a região de interesse indicado pela caixa vermelha no painel de topo. Média aumenta fNADH com comprimento de ciclo reduzido. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figura 3. fNADH imagens de toda a superfície anterior de uma biventricular isolado coração de coelho. O coração estava acelerado da RA a 200 bpm e 400 bpm. fNADH foi fotografada (2 fps, 128x128 pixels com uma resolução de 0,4 mm), enquanto iluminando todo o epicárdio anterior usando dois LEDs de alta potência (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

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A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+(ED-FRAP).">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li><li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Semi-)quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart.">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li><li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH,+cytosolic+redox+state,+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts.">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li><li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism.">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O coração isolado perfundido Langendorff continua a ser uma ferramenta importante para o estudo da fisiologia cardíaca 2. É especialmente útil em estudos de arritmias cardíacas, particularmente aqueles que utilizam imagens de fluorescência do potencial transmembranar 20. Uma vantagem é que o epicárdio inteira do coração isolado pode ser observado 21, 22. Outra vantagem é que, em contraste com o sangue, a perfusão com uma solução clara cristalóide tampão não interferir com os sinais de fluorescência. Uma limitação é que a técnica de Langendorff não é bem adequado para estudos de metabolismo cardíaco, que muitas vezes exigem o coração para realizar o trabalho dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Para elevar a relevância de preparações de coração isolado para estudos metabólicos, Neely introduzidas modificações à técnica Langendorff estabelecer adequada pré-carga do ventrículo esquerdo (LV) e as pressões pós-carga 3.O modelo é conhecido como o modelo de coração isolado LV de trabalho e tem sido utilizado extensivamente para estudar LV desempenho e metabolismo 4-6. A LV modelo de coração de trabalho é superior ao modelo Langendorff para avaliações funcionais, no entanto, não fornece um ventrículo carregado corretamente direito (VD). Demmy et al. relatada pela primeira vez um modelo biventricular (VE e VD) como uma modificação do modelo de coração LV de trabalho 7, 8. Eles descobriram que o desenvolvimento do volume sistólico, débito cardíaco e pressão melhorou nos corações convertidos do modo de trabalho LV para o modo de trabalhar biventricular 8. A RV carregado corretamente também melhora a função septal diminuindo gradientes de pressão anormais através do septo. Biventriculares corações de trabalho têm sido mostrados para manter o débito da aorta, fluxo pulmonar, pressão média da aorta, a média pressão pulmonar, a frequência cardíaca e enfarte do ATP, e os níveis de fosfato de creatina por até 3 horas 8. Biventriculares estudos cardíacos trabalho normalmente usam corações franimais om pequenos, tais como ratos e coelhos, porque o débito cardíaco e do volume necessário de perfusato são muito menos do que aquele para corações de animais maiores. No entanto, estudos cardíacos biventriculares de trabalho foram realizadas em corações de suínos, caninos, e até seres humanos 23, 24. A procura metabólica de corações isolados em modo de funcionamento biventricular é consideravelmente mais elevada do que a de perfusão de Langendorff. É importante que a solução perfusato fornecer oxigénio suficiente e substrato metabólico para suportar a função cardíaca biventricular. Padrão soluções tampão cristalóide, tais como solução de Krebs-Henseleit 16, 17, 25 ou Tyrodes 26, 27, têm solubilidades de oxigénio tão elevada como 5,6 mg / L. Quando estas soluções são gaseificada com carbogénio (uma mistura gasosa de 95% de O2 e 5% de CO 2) e contêm substrato metabólico adequado (glucose, dextrose, e / ou de piruvato de sódio), eles são apropriados para biventriculares corações de trabalho batendo na normaal taxas sinusal (aproximadamente 180 bpm para um coelho). Aumenta a demanda metabólica para ritmos rápidos e da quantidade de oxigênio dissolvido no perfusato padrão pode não ser suficiente para suportar totalmente o coração biventricular trabalho que está se contraindo a taxas elevadas. Soluções tampão cristalóides contendo eritrócitos ou misturado com sangue inteiro têm sido utilizados em preparações de coração de trabalho para assegurar a disponibilidade de oxigénio adequada. Estudos anteriores demonstraram que a adição de eritrócitos a uma solução de Krebs-Henseleit a melhoria da função cardíaca de trabalho durante a protocolos de estimulação rigorosas e também reduziu a incidência de fibrilação ventricular 16. Uma limitação do uso de eritrócitos ou misturas de sangue total é que a hemoglobina interfere com comprimentos de onda de luz que são usados ​​para a fluorescência de imagem 13. Outros substratos, tais como albumina, podem também ser adicionados ao perfusato soluções para prolongar a viabilidade do coração e reduzir o edema 28. Durante as imagens de fluorescência a intensidade da luz de excitação deve ser elevada ea distribuição da luz deve ser uniforme. Conseguir uma iluminação uniforme nem sempre é fácil devido à curvatura da superfície epicárdica. Nos nossos estudos, imagem fNADH por filtragem de luz (350 ± 25 nm) a partir de uma lâmpada de mercúrio. A bifurcada fibra óptica guia de luz é usada para direcionar a luz UV para a superfície epicárdica. Iluminação uniforme pode ser conseguido através do posicionamento adequado dos dois virolas de saída. UV fontes de luz LED poderia também ser usado, como já demonstrado na Figura 3. Fontes de LED são relativamente baratos para múltiplas fontes poderia ser incorporada um sistema de imagem. LEDs podem também ser reciclados e desligar a taxas elevadas para sincronizar luz de excitação com a aquisição de imagem. Fotobranqueamento de NADH deve ser minimizada 29, reduzindo o tempo de iluminação do tecido. Isto pode ser feito por bicicleta a iluminação e desligado usando um electrãoic do obturador e uma lâmpada ou com um sistema de iluminação de LED e um controlador. Se a iluminação é sincronizado com o ciclo cardíaco, em seguida, a aquisição da imagem fNADH poderia ser confinada a diástole, o que reduziria artefacto movimento nos sinais de fluorescência. Trigging iluminação e aquisição de imagem usando um sinal de pressão, tais como pressão do VE, seria uma maneira de fazer isso. Nos nossos estudos observou-se que alterações na fNADH por unidade de tempo pode ser mais do que 5X superior a 400 batimentos por minuto do que a 200 batimentos por minuto. Isto indica que os ritmos rápidos elevar o estado redox do coração. Seja ou não este é causado por hipóxia ou a incapacidade de miócitos para oxidar NADH a NAD + com rapidez suficiente para evitar o acúmulo de NADH é ainda uma questão sem resposta. O desempenho de uma preparação cardíaca biventricular de trabalho é subordinada múltiplos fatores. Um dos mais importante é definir pressões adequadas de pré-carga e pós-carga para imitar o fisiológicocondições que estão sob investigação. Em particular, a pós-carga LV (pressão aórtica) deve ser ajustada para representar a pressão sistémica. Se for demasiado elevada, a VE não será capaz de ultrapassar a pressão, resultando em regurgitação. Pressão muito baixa afetará adversamente a perfusão coronária. A pressão de pré-carga LV (pressão do átrio esquerdo) deve também ser ajustada para proporcionar um volume final diastólica, que é apropriado para o protocolo experimental. fNADH imagiologia de tecido vivo é um modo estabelecido de fluorescência de imagem 13. Sua aplicação em tecido cardíaco foi ilustrado por Barlow e Chance quando relataram elevações marcantes da fNADH no tecido regional isquêmico após a ligadura de um vaso coronário 14. Suas imagens fNADH foram registrados em filme usando uma câmera osciloscópio Fairchild e fotografia com flash UV. Coremans et al. expandida este conceito usando o NADH rácio de reflectância de fluorescência / UV para measure no estado metabólico do epicárdio do coração de Langendorff sangue-perfundidos de rato 30. Um videofluorimeter foi usado para geração de imagens e os dados foram registados usando um gravador de vídeo. Mais tarde, Scholz et ai. utilizado um espectrógrafo de matriz e fotodiodo para medir fNADH média a partir de uma grande área de VE. Essa abordagem reduz os efeitos de heterogeneidades epicárdicos fluorescência e variações locais em circulação, enquanto revelando macroscópicas relacionadas ao trabalho variações de fNADH 31. Esta abordagem é semelhante aos níveis médios de computação fNADH para uma região de interesse em todos os quadros de um conjunto de dados de imagem fNADH, como ilustrado na Figura 2. Como já apresentado neste artigo, a tecnologia de hoje oferece câmeras de alta velocidade controlada digitalmente CCD e holofotes de alta potência UV. Essas tecnologias permitem que a dinâmica espaço-temporais de fNADH e metabolismo cardíaco a ser estudado a partir de muitas perspectivas novas. O custo relativamente baixo das ópticas e fonte de luz faz com que fNADH a imagem de um acessório útil para cardíacos convencionais sistemas de mapeamento ópticos. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> De NaHCO3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 233-S </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158.968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts

Desde a sua criação por Langendorff 1, o coração isolado perfundido continua a ser uma ferramenta importante para o estudo da fisiologia cardíaca 2. No entanto, não é bem adequado para estudos de metabolismo cardíaco, que requerem o coração para realizar o trabalho dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Modificações introduzidas Neely para a técnica de Langendorff para estabelecer adequada pré-carga do ventrículo esquerdo (LV) e as pressões pós-carga 3. O modelo é conhecido como o modelo de coração isolado LV de trabalho e tem sido utilizado extensivamente para estudar LV desempenho e metabolismo 4-6. Este modelo, no entanto, não proporciona um ventrículo adequadamente carregado direito (VD). Demmy et al. relatada pela primeira vez um modelo biventricular como uma modificação do modelo de coração LV de trabalho 7, 8. Eles descobriram que o desenvolvimento do volume sistólico, débito cardíaco e pressão melhorou nos corações convertidos do modo de trabalho LV para o modo de trabalhar biventricular 8 </sup&gt;. A RV carregado corretamente também diminui gradientes de pressão anormais através do septo para melhorar a função septal. Biventriculares corações de trabalho têm sido mostrados para manter o débito da aorta, fluxo pulmonar, pressão média da aorta, a frequência cardíaca, e os níveis de ATP miocárdio por até 3 horas 8. Ao estudar os efeitos metabólicos da lesão do miocárdio, tais como isquemia, é frequentemente necessário para identificar a localização do tecido afectado. Isto pode ser feito por imagem a fluorescência de NADH (a forma reduzida do dinucleótido de nicotinamida adenina) 9-11, uma coenzima encontrados em grandes quantidades nas mitocôndrias. NADH fluorescência (fNADH) exibe uma relação inversa com perto de linearmente 12 locais de oxigénio concentração e fornece uma medida do estado redox mitocondrial 13. fNADH imagiologia durante condições hipóxicas e isquémicas tem sido utilizado como um método de corante-se livre para identificar regiões hipóxicas 14, 15 e para monitorizar a progressão dacondições hipóxicas ao longo do tempo 10. O objectivo do método é para monitorar o estado redox mitocondrial de biventriculares corações de trabalho durante protocolos que alteram a taxa de metabolismo dos miócitos ou induzir hipóxia ou criar uma combinação dos dois. Corações provenientes de coelhos brancos da Nova Zelândia foram ligados a um sistema de coração biventricular de trabalho (Hugo Sachs Elektronik) e perfundidos com solução modificada de Krebs-Henseleit 16 a 37 ° C. Aórtica, LV, da artéria pulmonar, e esquerda e direita pressões atriais foram registrados. A atividade elétrica foi medida usando um eletrodo de potencial monofásico ação. Para imagem fNADH, a luz de uma lâmpada de mercúrio foi filtrada (350 ± 25 nm) e usado para iluminar o epicárdio. Luz emitida foi filtrada (460 ± 20 nm) e fotografada com uma câmara CCD. As alterações na fNADH epicárdica de biventriculares corações de trabalho durante as taxas de estimulação de diferentes são apresentadas. A combinação do modelo de coração e de imagem fNADHfornece uma ferramenta nova e valiosa para o estudo experimental patologias cardíacas agudas dentro do contexto de realistas condições fisiológicas.

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

O objectivo é para monitorar o estado redox mitocondrial de corações isolados dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Um modelo de coração biventricular trabalhando coelho é apresentado. Alta resolução espaço-temporal de imagens de fluorescência de NADH é usado para monitorar o estado redox mitocondrial do tecido epicárdico.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

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