Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
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Recherche dans notre laboratoire a été soutenu par l&#39;Institut Max von Pettenkofer, Ludwig-Maximilians-Universität de Munich, de la recherche allemande (DFG, HI 1511/3-1) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) «Génomique des infections médicales&quot; initiative ( 0315834C).

1. Préparatifs pour l&#39;isolement LCV <ol><li> Streak à Legionella pneumophila produire DsRed-Express 13,14 à partir de stocks de glycérol sur gélose CYE avec 5 pg / ml de chloramphenicol (Cam) quatre jours avant l&#39;isolement LCV. Incuber les bactéries à 37 ° C. </li><li> Semences à 1 x 10 7 D. discoideum produire GFP-calnexine ou RAW264.7 macrophages murins dans 75 cm de culture tissulaire 2 flacons une infection jour avant. Utilisez 10 ml HL5 moyenne a...

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	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. 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E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. 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Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

Contrairement aux méthodes déjà publiées, ce protocole est basé sur deux étapes, d&#39;abord la séparation des véhicules utilitaires par une approche immuno-magnétique, et la seconde, la purification de véhicules utilitaires par centrifugation en gradient de densité. L&#39;isolement LCV peut être facilement suivie par microscopie à fluorescence, soit quand les bactéries marquées par fluorescence et GFP-cellules productrices ou coloration anticorps est utilisé. Le protocole décrit ici est un simple, stra...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

Le pathogène opportuniste Legionella pneumophila est une bactérie résistante aux amibes, qui reproduit également dans les macrophages alvéolaires causant ainsi la pneumonie sévère &quot;la maladie du légionnaire&quot; 1. Dans les phagocytes protozoaires et les mammifères, L. pneumophila emploie un mécanisme conservé pour former un particulier, la réplication permissive compartiment, la &quot;Legionella contenant vacuole&quot; (LCV). La formation exige que le LCV bactérienne Icm / Dot système de sécrétion de type IV (T4SS), qui translocation jusqu&#39;à 275 &quot;effecteurs&quot; protéines dans les cellules hôtes. Les effecteurs de manipuler protéines de l&#39;hôte ainsi que des lipides et de communiquer avec sécrétoire, organites endosomes et mitochondrial 2-4. La formation de véhicules utilitaires légers représente un processus complexe, robuste et redondant, ce qui est difficile à saisir d&#39;une manière réductionniste. Une approche intégrative est nécessaire pour complètement comprendre la formation des LCV, y compris une analyse globale de la trajectoireles interactions de facteurs fibrinogène-hôtes et de leurs dynamiques temporelles et spatiales. Comme une première étape vers cet objectif, véhicules utilitaires intactes sont purifiés et analysés par la protéomique et la lipidomique. La composition et la formation de micro-organismes pathogènes contenant des vacuoles a été étudié par analyse protéomique par chromatographie en phase liquide ou 2-D électrophorèse sur gel couplée à la spectrométrie de masse. Vacuoles isolées soit de la discoideum sol social amibe Dictyostelium ou phagocytes de mammifères nourrissait Leishmania 5, 6 Listeria, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 ou Salmonella Legionella spp. 10. Cependant, les protocoles de purification utilisées dans ces études sont longues et fastidieuse, car elles nécessitent par exemple la microscopie électronique pour analyser la morphologie des LCV, l&#39;intégrité et la pureté. En outre, ces protocoles ne pas exploiter les caractéristiques spécifiques de la vacuole pathogène pour enenrichissement par. La méthode présentée ici permet de surmonter ces limitations en utilisant D. discoideum production d&#39;un marqueur fluorescent TR et en ciblant la protéine bactérienne SIDC effecteur, qui sélectivement ancres à la membrane par TR se lier à la phosphatidylinositol-4-phosphate (PtdIns (4) P) 3,11. VU sont enrichis dans une première étape par immuno-magnétique de séparation en utilisant un anticorps purifié par affinité primaire contre SIDC et un anticorps secondaire couplé à des billes magnétiques, suivie d&#39;une deuxième étape d&#39;une centrifugation en gradient de densité classique Histodenz 12,13 (fig. 1) . Une étude du protéome de véhicules utilitaires légers isolés de D. discoideum a révélé plus de 560 protéines de la cellule hôte, y compris les protéines associées à des vésicules phagocytaires, les mitochondries, ER et appareil de Golgi, ainsi que plusieurs GTPases qui n&#39;ont pas été impliqués dans la formation avant le 13 LCV. VU enrichi et purifié avec leprotocole décrit ici peut être encore analysés par microscopie (immunofluorescence, microscopie électronique), des méthodes biochimiques (Western blot) et des approches protéomiques ou lipodimique.

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Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Cet article décrit une méthode pour l&#39;isolement et la purification de intacts<em&gt; Legionella</em&gt; Contenant des vacuoles (VU) de l&#39;amibe et les macrophages. Le protocole en deux étapes comprend l&#39;enrichissement TR par immuno-magnétique séparation utilisant un anticorps dirigé contre un marqueur bactérien TR et la purification en outre par centrifugation en gradient de densité.

Purification de vacuoles agent pathogène à partir<em&gt; Legionella</em&gt; Infectées par les phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Recherche

Immunologie et infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Purification et visualisation de lipopolysaccharide de bactéries à Gram négatif par Hot-phénol aqueux d&#39;extraction

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

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Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

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ARN Purification de Intracellulairement Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Dans les cellules macrophages

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Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

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Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...