Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
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Forschung in unserem Labor wurde von der Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HALLO 1511/3-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Medical Infektion Genomics&quot;-Initiative unterstützt ( 0315834C).

1. Die Vorbereitungen für LCV Isolation <ol><li> Streak aus Legionella pneumophila Herstellung DsRed-Express 13,14 Aktien aus Glycerin auf CYE-Agar-Platten mit 5 ug / ml Chloramphenicol (Cam) vier Tage vor LCV Isolation. Inkubieren der Bakterien bei 37 ° C </li><li> Seed aus 1 x 10 7 D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin oder RAW264.7 murinen Makrophagen in 75 cm 2 Zellkulturflaschen einen Tag vor Infektion. Verwenden Sie 10 ml HL5 Medium mit 20 ug / mL G418 für <...

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	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. 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Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Verfahren wird dieses Protokoll auf zwei Schritten, zuerst die Trennung von leichten Nutzfahrzeugen mit einem Immuno-magnetische Ansatz und zweiten, die Reinigung von leichten Nutzfahrzeugen durch Dichtegradientenzentrifugation bezogen. Die LCV Trennung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn entweder fluoreszenzmarkierten Bakterien und GFP-produzierenden Zellen oder Antikörper-Färbung verwendet wird, gefolgt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, unkompli...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

Die opportunistischen Erreger Legionella pneumophila ist eine Amöbe-resistentes Bakterium, das auch den Wiederholungen in Alveolarmakrophagen wodurch die schweren Lungenentzündung &quot;Legionärskrankheit&quot; ein. In Protozoen-und Säugetier-Phagozyten, L. pneumophila beschäftigt konservierten Mechanismus, um eine bestimmte, Replikations-permissive Fach, die &quot;Legionellen-enthaltenden Vakuolen&quot; (LCV) zu bilden. LCV Bildung erfordert die bakterielle Icm / Dot-Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), was so viel wie 275 &quot;Effektor&quot; transloziert Proteine ​​in Wirtszellen. Die Effektoren manipulieren Host-Proteinen sowie Lipide und kommunizieren mit sekretorischen, endosomalen Organellen und Mitochondrien-04.02. Die Bildung von leichten Nutzfahrzeugen stellt eine komplexe, robuste und redundante Prozess, der nur schwer in einer reduktionistischen Weise zu erfassen ist. Ein integrativer Ansatz ist erforderlich, um umfassend zu verstehen LCV Bildung, einschließlich einer globalen Analyse Wegogen-Host-Faktor-Wechselwirkungen und ihre zeitliche und räumliche Dynamik. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel werden intakte leichte Nutzfahrzeuge gereinigt und analysiert durch Proteomik und Lipidomik. Die Zusammensetzung und die Bildung von Erreger-enthaltenden Vakuolen durch Proteom-Analyse durch Flüssigkeitschromatographie oder 2-D Gelelektrophorese gekoppelt Massenspektrometrie untersucht. Vakuolen entweder von der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum Boden oder Säugetier-Phagozyten isoliert hegte Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 oder Salmonella Legionella spp. 10. Allerdings sind die Aufreinigungsprotokolle in diesen Studien beschäftigt zeitraubend und langweilig, wie sie z. B. Elektronenmikroskopie zu LCV Morphologie, Integrität und Reinheit zu analysieren erfordern. Darüber hinaus müssen diese Protokolle nicht ausnutzen Besonderheiten des Erregers Vakuole für dereicherung. Die hier vorgestellte Methode überwindet diese Einschränkungen durch den Einsatz von D. discoideum Herstellung eines fluoreszierenden Marker und LCV durch Targeting des bakteriellen Effektorprotein SidC, die selektiv Anker auf die LCV Membran durch Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. LCV in einem ersten Schritt mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC und einen sekundären Antikörper an magnetische Beads gekoppelt ist, in einem zweiten Schritt durch eine klassische Histodenz Dichtegradientenzentrifugation 12,13 (Abb. 1), gefolgt angereichert . Ein Proteom-Studie von isolierten leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum ergab mehr als 560 Wirtszellproteinen, einschließlich Proteine ​​mit phagozytischen Vesikel, Mitochondrien, ER und Golgi, sowie mehrere GTPasen, die nicht in LCV Bildung wurden vor dem 13. beteiligt zugeordnet. LCV angereichert und gereinigt mit derProtokoll hier skizzierten kann durch Mikroskopie (Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie), biochemischen Methoden (Western Blot) und Proteomik oder der Lipid Ansätze analysiert werden.

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Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten<em&gt; Legionellen</em&gt;-Haltigen Vakuolen (leichte Nutzfahrzeuge) von Amöben und Makrophagen. Das Zwei-Schritt-Protokoll umfasst LCV Anreicherung mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bakterielles LCV-Marker und weitere Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation.

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Forschung

Immunologie und Infektion

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...