Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

מחקר במעבדה שלנו נתמך על ידי מקס פון Pettenkofer המכון, לודוויג מקסימיליאן, אוניברסיטת מינכן, קרן המחקר הגרמנית (DFG, HI 1511/3-1) ואת הפרווה Bundesministerium Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Genomics זיהום רפואי&quot; היוזמה ( 0315834C).

1. ההכנות בידוד LCV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס ייצור את הלגיונלה pneumophila DsRed-Express 13,14 ממניות וגליצרול על צלחות אגר CYE עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol (רמ&quot;א) ארבעה ימים לפני בידוד LCV. דגירה של חיידקים על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את ז?...

<ol>
	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

בניגוד לשיטות שפורסמו בעבר, פרוטוקול זה מבוסס על שני שלבים, 1 הפרדת LCVs ידי גישה חיסונית מגנטי, והשני, טיהור LCVs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בידוד LCV ניתן בעקבות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כאשר גם חיידקים שכותרתו fluorescently ו-GFP תאים מייצרי נוגדנים או כתמים משמש. ?...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

פתוגן אופורטוניסטי הלגיונלה pneumophila הוא חיידק עמיד אמבה, אשר גם משכפל ב מקרופאגים מכתשיים ובכך גורם לדלקת ריאות חמורה &quot;הליגיונרים&quot; מחלה &quot;1. ב phagocytes protozoan ו יונקים, ל pneumophila מעסיקה מנגנון משומר כדי ליצור מסוים, שכפול התא, מתירנית, &quot;הלגיונלה המכיל vacuole&quot; (LCV). היווצרות LCV דורש חיידקי ICM / דוט סוג מערכת הפרשת IV (T4SS), אשר translocates רבים כמו 275 &quot;מפעיל&quot; חלבונים לתוך התאים המארחים. Effectors לתפעל את החלבונים המארחות, כמו גם שומנים לתקשר עם הפרשה, האברונים endosomal ואת המיטוכונדריה 2-4. היווצרות LCVs מהווה תהליך מורכב, חזק מיותר, שהיא קשה להבנה בצורה רדוקציוניסטית. גישה אינטגרטיבית נדרש להבין באופן מקיף היווצרות LCV, כולל ניתוח גלובלי של נתיבעוגן מארח גורם האינטראקציות והדינמיקה הזמן והמרחב שלהם. כצעד ראשון לקראת מטרה זו, LCVs שלמים הם מטוהרים ונותחו על ידי proteomics ו lipidomics. הרכב היווצרות של הפתוגן המכילים vacuoles נחקר על ידי ניתוח proteomic באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית או 2-D ג&#39;ל אלקטרופורזה מצמידים את ספקטרומטר מסה. Vacuoles מבודד או discoideum אדמה חברתית אמבה Dictyostelium או phagocytes יונקים טיפח שושנת יריחו 5, 6 ליסטריה, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 או סלמונלה הלגיונלה spp. 10. עם זאת, הפרוטוקולים טיהור המועסקים מחקרים אלה זמן רב ומייגע, כפי שהם דורשים מיקרוסקופ אלקטרונים למשל לנתח מורפולוגיה LCV, יושר וטוהר. בנוסף, פרוטוקולים אלה אינם מנצלים תכונות ספציפיות של vacuole הפתוגן עבור enrichment. השיטה המוצגת כאן מתגבר על מגבלות אלה על ידי העסקת ד discoideum לייצר סמן פלואורסצנטי LCV ועל ידי מיקוד SidC חיידקי חלבון מפעיל, אשר סלקטיבי עוגנים קרום LCV באמצעות קשירה phosphatidylinositol 4-פוספט (PtdIns (4) P) 3,11. LCVs מועשרים בשלב הראשון על ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדן זיקה-מטוהרים העיקרי נגד SidC ו נוגדנים משני מצמידים את החרוזים מגנטיים, ולאחר מכן בשלב השני על ידי צנטריפוגה קלאסית צפיפות Histodenz שיפוע 12,13 (איור 1) . המחקר proteome של LCVs מבודד ד discoideum עולה יותר מ 560 התא המארח חלבונים, כולל חלבונים הקשורים שלפוחית ​​phagocytic, המיטוכונדריה, מיון, Golgi, כמו גם GTPases שונים, אשר לא היו מעורבים ביצירת LCV לפני 13. LCVs מועשר מטוהרים עםפרוטוקול המתואר כאן ניתן לנתח עוד יותר על ידי מיקרוסקופ (immunofluorescence, במיקרוסקופ אלקטרונים), בשיטות ביוכימיות (מערב כתם) וגישות proteomic או lipidomic.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של שלמה<em&gt; הלגיונלה</em&gt; המכילים vacuoles (LCVs) של אמבה ומקרופגים. פרוטוקול שני שלבים כולל העשרת LCV ידי הפרדה חיסונית מגנטי באמצעות נוגדנים נגד סמן LCV חיידקים טיהור נוספת על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות.

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...