Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
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私たちのラボでの研究は、マックス·フォン·ペッテンコーファー研究所、ルートヴィヒ·マクシミリアン大学、ミュンヘン、ドイツ研究協会（DFG、HI 1511/3-1）とBundesministeriumエリーゼBildungウントForschung（BMBF） &quot;医療感染ゲノム&quot;イニシアティブによってサポートされていました（ 0315834C）。

1。 LCVアイソレーションの準備<ol><li> レジオネラ出ストリークは、4日間の小型商用車の分離前に5μg/ mLのクロラムフェニコール（CAM）を使用したCYE寒天プレートにグリセロールストックからDsRedタンパク質-Expressの13,14を生成します 。 37細菌をインキュベート℃に</li><li> 1×10 のうち7種D. GFP-カルネキシンまたは75 cm 2の組織培養におけるRA...

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	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

以前に公開された方法とは対照的に、このプロトコルは、2つのステップは、最初の免疫磁気アプローチによる小型商用車の分離、そして第二に、密度勾配遠心分離により小型商用車の精製に基づいています。 LCVの分離が容易に蛍光標識した細菌やGFP産生細胞または抗体染色のいずれかが使用されている蛍光顕微鏡、続くことができます。ここで説明するプロトコルは、高純度の小型商用車?...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

日和見病原体レジオネラはまた、このように重症肺炎&quot;レジオネラ症&quot; 1の原因となる肺胞マクロファージで複製アメーバ耐性菌です。原生動物や哺乳類の食細胞で、L.レジオネラは 、特定の複製許容コンパートメント、 &quot; レジオネラ菌を含む液胞&quot;（LCV）を形成するために保存されたメカニズムを採用しています。 LCVの形成は、宿主細胞に、多くの275 &quot;エフェクター&quot;のタンパク質を移行し、細菌ICM /ドットIV型分泌系（T4SS）が必要です。エフェクターは宿主タンパク質と同様に脂質を操作し、分泌、エンドソームやミトコンドリアの細胞内小器官2から4と ​​通信します。 小型商用車の形成は、還元の方法で把握することが困難であり、複雑な堅牢かつ冗長なプロセスを表します。統合的なアプローチは、パスのグローバルな分析を含む、包括的にLCVの形成を理解する必要がありますogen - 宿主因子の相互作用とそれらの時間的および空間的ダイナミクス。この目標に向けた第一歩として、無傷の商用車は、プロテオミクスとリピドミクスで精製し、分析されます。 組成や病原体を含有する液胞の形成は、液体クロマトグラフィーや質量分析に結合された2-Dゲル電気泳動を用いたプロテオーム解析により検討されています。社会的な土壌アメーバキイロタマホコリカビや哺乳類の食細胞のいずれかから単離された小胞は、 リーシュマニア 5、 リステリア菌 6 菌 7、 ロドコッカス 8、 サルモネラ 9またはレジオネラ属菌をかくまった10。彼らは、例えば電子顕微鏡は、LCVの形態、整合性と純度を分析する必要がしかし、これらの研究で用い精製プロトコルは、時間のかかる退屈な作業です。さらに、これらのプロトコルは、専用のために病原体胞の特定の機能を利用しないrichment。 ここで紹介する方法は、Dを用いることにより、これらの制限を克服ホスファチジルイノシトール4 -リン酸（PtdIns（4）P）3,11に結合することにより、蛍光LCVマーカーを生産し、細菌のエフェクタータンパク質SIDCを対象に、どのLCV膜に選択的にアンカーでdiscoideumの 。小型商用車は、古典的Histodenz密度勾配遠心分離12,13（ 図1）第二段階に続いて磁気ビーズに結合されたSIDCと二次抗体に対するアフィニティー精製一次抗体を使用して、免疫磁気分離による最初のステップで濃縮され。 D.から単離された小型商用車のプロテオーム研究discoideumのは 13前にLCVの形成に関与していない食胞、ミトコンドリア、小胞体とゴルジ体と同様に、いくつかの低分子量GTPase、関連付けられたタンパク質を含む560以上の宿主細胞タンパク質を、明らかにした。小型商用車はで濃縮および精製プロトコルは、さらに顕微鏡（免疫蛍光法、電子顕微鏡）、生化学的方法（ウエスタンブロット）およびプロテオミクスまたはlipidomicアプローチによって分析することができますここで概説した。

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Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

この資料では、無傷の単離および精製する方法を説明します<em&gt;レジオネラ菌</emアメーバやマクロファージからの&gt;を含む液胞（商用車）。 2ステップのプロトコルは、密度勾配遠心法により細菌のLCVマーカー、さらに精製することに対する抗体を用いた免疫磁気分離による濃縮LCVで構成されています。

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...